科学家们经常使用技术来改变基因表达或标记特定的细胞，但在一开始就教会学生如何进行这些实验的资源太少了。在大多数课堂上，实验室经验集中在经典胚胎学技术，如基础观察和解剖。学生们通常不会使用遗传学或分子生物学中使用的更现代的技术，因为这些实验对业余科学家来说要么不容易获得，要么太有挑战性。涡虫，一种在淡水池塘中常见的蠕虫生物，为这个问题提供了一个很好的潜在解决方案。真涡虫很容易购买、培养，而且有有趣的表型可供研究。此外,桑切斯实验室已经使得在最近质粒沉积的真涡虫身上进行高级发育生物学实验变得更容易。
这些质粒可以进行两种主要的实验:
- 整个山原位杂交（希望）用于基因的可视化表达。
- 双链RNA (dsRNA)介导的RNA干扰(RNAi)来敲低特定基因的表达。
这49个储存的质粒使学生能够研究四种廉价且商业可用的真虫的基因表达和关键再生相关基因的功能:吉拉氏体、多托头体、摩氏巨噬体和细鳞巨噬体。有11种不同的基因被克隆到质粒中，用于研究这些涡虫的每一种。
这些质粒都有PR-T4载体骨干，这是改良版的L440．该载体用途广泛，既可用于原位杂交，也可用于dsrna诱导的RNAi实验。值得注意的是，该质粒含有T7启动子两侧的多克隆位点，允许双向转录生成dsRNA。学生可以从相同的质粒上通过PCR生成DNA模板，并利用这些模板创建用于原位杂交实验的核糖探针。
最近出版的刊物[1]描述了WISH和RNAi实验所需的质粒和协议，以及如何进行蠕虫截肢。他们还创建了一个名为”旷课”提供了更详细的材料和协议资源。
通过Whole Mount可视化基因表达原位杂交(希望)
WISH是一种检测mRNA转录本在组织中时间和空间定位的技术。这对于标记特定的细胞类型和观察基因表达随时间或基因操作后的变化是有用的。这项技术涉及使用合成的RNA(核糖探针)与修改的核苷酸(例如，地高黄素标记的尿嘧啶)，将结合到胚胎或组织中的互补mRNA。一旦创建了核糖探针，WISH协议包括组织样本的准备、几次洗涤和温度变化，以可视化特定基因的表达。在核探针结合(通过杂交)后，检测mrna -核探针复合物的特异性抗体被添加到组织中。最后一步是化学反应，将含有mrna -核糖探针-抗体复合物的细胞染色，结果，这些细胞变成蓝色。
学生们可以利用线性化的DNA模板来合成核糖探针，他们可以通过PCR从圆形质粒中轻松生成这种模板。通常，为了构建这些结构，发育生物学家必须从他们感兴趣的生物体中提取RNA，使用RNA创建互补DNA (cDNA)，然后使用PCR和分子克隆将cDNA插入所需的质粒骨干。Sánchez实验室的质粒允许学生和新实验室绕过这些步骤，专注于WISH技术。Sánchez实验室出版物[1]描述了11种不同的真孢虫基因(所有这些基因都可以通过沉积获得)的表达模式，以便进行这些实验的学生有一个良好的基线进行比较。执行希望使用这些质粒可以在真涡虫中标记特定的细胞类型或整个器官。例如，基因匹威标记新生细胞和基因原激素转化酶2标记中枢神经系统。
利用RNA干扰(RNAi)评价基因功能
RNA干扰(RNAi)是一种强大的工具，用于对感兴趣的基因进行靶向敲除，并首次在一种不相关的蠕虫(秀丽隐杆线虫)[2]。传递匹配特定mRNA序列的dsRNA会触发一系列事件，导致目标mRNA的降解并使其表达沉默。更具体地说，在RNAi的过程中，一种被称为Dicer的酶将dsRNA切成更小的块。这些较小的dsRNA片段被称为小干扰rna (siRNA)，它们与一类Argonaute蛋白结合。Argonaute蛋白去除siRNA的一条链，并通过与其余单链siRNA的互补作用而与本地表达的mrna结合。这些天然mrna随后被阿尔贡酶催化的核酸酶活性破坏，或通过翻译机制的物理阻断而中断翻译。
在Sánchez实验室协议中，dsrna是通过喂食真涡虫来传递的。根据研究对象是哪种涡虫，研究方案略有不同。例如,Girardia sp。和Dugesia dorotocephala能不能喂表达dsrna的大肠杆菌和肝酱混合。在和肝酱混合之前，这些大肠杆菌转化相应的质粒，通过诱导T7聚合酶激活dsRNA表达大肠杆菌基因组(通常由IPTG控制)。为了使iptg诱导的表达发挥作用，学生们必须使用广告大肠杆菌应变,指定为DE3．
为Phagocata morgani和Phagocata gracillis在美国，这个过程稍微复杂一些。这些菌株的食用者比较挑剔，拒绝食用混有肝酱的食物大肠杆菌．因此，要让dsRNA进入Phagocata morgani和Phagocata gracillis在美国，人们必须从细菌中纯化双链rna，并将纯化的双链rna与肝酱混合，然后将混合物喂给蠕虫。
在三次喂食dsRNA后，RNAi敲减处理的表型应该是明显的。有些表型直到截肢后才明显。例如，在β -连环蛋白敲除后截肢后的真虫中可以观察到戏剧性的“双头”表型。其他的基因靶标不需要截肢就能看到。例如，odf2基因敲除导致一个可观察到的“响尾蛇”表型，扰乱野生型的运动。
创造你自己的质粒来研究真涡虫的其他基因!
对于那些有兴趣进行自己的分子克隆和研究不在本集合中的基因的人，他们可以克隆DNA序列，以创建核糖探针和dsrna进入PR-T4P．桑切斯实验室协议还为“最勇敢和更好奇的”学生提供了一步一步的指导，告诉他们如何克隆感兴趣的基因到空荡荡的PR-T4P载体骨干。
空向量PLL4，与PR-T4P相似，可从Addgene中获得。
如果您使用这些发布的协议，并希望分享图片，反馈等，请写信给cuttingclass@stowers.org如果你制造新的质粒来研究不同的涡虫基因，我们鼓励你去做将它们存入Addgene并扩大其他教室和研究人员可以轻松研究涡虫的基因数量。
参考文献
1.Alice Accorsi, Monique M. Williams, Eric J. Ross, Sofia M. C. Robb, Sarah A. Elliott, Kimberly C. Tu, Alejandro Sánchez Alvarado，美国生物老师第79卷第3期，2017年3月;(页208 - 223)。链接:http://abt.ucpress.edu/content/79/3/208
2.Fire, S. Xu, M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E. Driver, C.C. Mello。双链RNA在秀丽隐杆线虫。自然，391(1998)，806-811页。PubMedPMID: 9486653．
3.等。“摄入细菌表达的双链RNA可抑制真涡虫的基因表达。”美国国家科学院院刊One hundred.增刊1(2003):11861-11865。PubMedPMID: 12917490．公共医学中心PMCID: PMC304099．
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