最初发表于2016年10月11日，最后更新于2020年12月22日，作者是Benoit Giquel。
CRISPR由于其易于使用和在各种各样的生物体上的效用，已经席卷了基因组工程的世界。虽然目前CRISPR的很多研究集中在其在人类医学上的潜在应用(华尔兹，2016)，但CRISPR的潜在应用植物基因组工程也正在实现。考虑使用基因组编辑来改变植物的遗传密码有多种理由，包括开发具有更长的保质期的作物开发抗病作物以提高农业产量(Wang et al.， 2016;Wang et al.， 2014)．虽然使用传统的植物育种方法当然可以选择理想的性状，但这些技术很麻烦，通常需要几轮选择，以分离出表型感兴趣的植物。另一方面，基因组工程允许对已知或怀疑的基因进行靶向修饰，以调节所需的表现型。事实上，CRISPR已经被用于许多植物物种的基因组工程，包括常用的模式生物，如拟南芥和截茎苜蓿，以及包括土豆、玉米、番茄、小麦、蘑菇和水稻等多种作物物种(Khatodia et al.， 2016)。. 尽管CRISPR系统在大多数生物体中几乎具有普遍的功能，但为了在植物细胞中进行基因组编辑，需要对CRISPR成分进行一些植物特异性的改变。
这篇博客文章将介绍使用CRISPR的植物基因组工程的一般概述，重点介绍允许在植物中使用CRISPR的CRISPR机制的具体修改，并概述学术研究人员通过Addgene可以使用的各种植物基因组工程工具。
植物基因组工程CRISPR组件
CRISPR可以用来敲除、激活或抑制植物中的靶基因，使用的是在其他模式生物中开发的一般实验设计原则(参见我们的)CRISPR指南一般的CRISPR原则)。然而，要在植物细胞中使用CRISPR系统，必须对常用CRISPR质粒进行植物特异性修饰。像其他模型系统一样，表示链球菌Cas9或Cas9变体（以下简称Cas9）和单链引导RNA（gRNA）足以修饰植物细胞的基因组。gRNA的结构（由~20个核苷酸的靶向序列和~75个核苷酸的支架序列组成）在植物和其他生物体之间是一致的，但用于驱动gRNA表达的启动子取决于所讨论的细胞类型。在植物细胞中，gRNA表达是通过将gRNA置于植物特异性RNA pol III启动子的下游来实现的，如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3，这些启动子通常用于驱动小RNA的表达与它们各自的物种一样。Addgene携带>30“空gRNA”骨干它包含一个植物pol III启动子和gRNA支架序列，允许研究人员以最少的克隆需要插入靶向寡核苷酸。与其他模型系统一样，可以同时表达多个gRNAs来修饰多个基因组位点(在这里获取更多关于多路复用grna的信息）.
Cas9通常被标记有一个核定位序列，以增强对细胞核的靶向性，并且已经创建了几个密码子优化的Cas9变体，以增加特定植物物种或细胞类型的翻译(Belhaj等人，2013年)）. 基于核酸酶死亡Cas9（dCas9）的激活剂（如dCas9-VP64）或抑制剂（dCas9-KRAB或dCas9-SRDX）也可分别用于激活或抑制植物细胞中的靶基因。Cas9表达通常由植物源性RNA pol II启动子驱动，该启动子调节较长RNA的表达（如基因表达的mRNAs）。Cas9表达常用RNA pol II启动子的示例包括广泛表达的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV 35S）或泛素启动子（Belhaj et al.，2013）．Addgene携带含有cas9的质粒进行敲除，激活和镇压在植物中的靶基因和许多上述的空gRNA骨干还含有Cas9，它能够同时表达同一质粒上的Cas9和gRNA。
将CRISPR成分传送到植物细胞
一旦为应用程序选择了正确的CRISPR组件，就该将这些组件交付给目标单元了。记住，CRISPR成分的高效传递对于任何CRISPR实验都是至关重要的，在你的细胞系中不能表达gRNA或Cas9将导致实验失败。CRISPR成分的表达可以是稳定的，也可以是短暂的，这取决于传递方法和所涉及的细胞类型。CRISPR组分可以使用标准的洗涤剂聚乙二醇(PEG)瞬时传递和表达，尽管这种方法的应用仅限于原生质体细胞(细胞壁已被去除的植物细胞)。另一种常见的给药方法是农杆菌介导的给药，哪些使用土壤衍生的细菌一个grobacterium农作为载体，将你感兴趣的基因传递到目标细胞系或生物体(见图1)农杆菌属-介导的转化可以在其中找到博客. 这个pDGE Dicot基因组编辑试剂盒从Stuttmann实验室包含多种Agrobacterium-compatible， Cas9包含的载体可以通过金门介导克隆你感兴趣的gRNA。
近年来,deaminase-mediated基本编辑(胞嘧啶碱基编辑器或腺嘌呤碱基编辑器)和逆转录酶介导'编辑技术已经被证明是优秀的替代基因组编辑技术，特别是在人类细胞中。相比同源性定向修复，这些方法不涉及双链断裂（DSB）的形成，也不需要供体DNA。这些精确的编辑往往比HDR更有效(Zhu et al.， 2019）.胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器已被广泛应用为工厂开发的植物的主要编辑一直是为大米而开发的由齐一平的实验室和大米和小麦高彩霞的实验室。
最近开发的方法也可以用来有效地将CRISPR-Cas9成分转移到植物中。纳米颗粒(碳纳米管，Kwak et al.， 2019)、DNA纳米结构(Zhang et al.， 2019)或细胞穿透肽(Santana et al.， 2020)和植物病毒(大麦黄色条纹花叶病毒(Gao et al.， 2019)或sonchus黄色网状横纹病毒(Ma et al.， 2019)。2020年)已经被证明是将CRISPR-Cas9传递到植物细胞的有效方法，应该被认为是PEG或农杆菌介导传递的替代方法。
总结
尽管在许多细节上有所不同——使用的启动子、精确的蛋白质序列或结构域以及传递方法——植物中CRISPR介导的基因组工程的基础技术与在其他系统中使用的技术并没有太大的不同。幸运的是，你不必寻找具有植物特异性修饰基因的质粒靶向您喜爱的植物基因所需的质粒；您可以在植物中找到许多用于多种CRISPR应用的质粒可以通过Addgene. 除了上述质粒外，Addgene还携带几种有用的CRISPR工具包，用于创建植物表达质粒，包括植物CRISPR来自齐一平实验室的质粒和MoClo植物部件工具包来自Patron实验室。与存储库中的所有质粒一样，我们强烈建议阅读相关的出版物或协议，以最大限度地利用您为实验选择的质粒，但是，如果您正在研究植物，不要害怕尝试CRISPR。
工具书类
Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V(2013)植物基因组编辑变得容易:利用CRISPR/Cas系统在模型和作物植物中进行靶向突变。植物方法9:39。https://doi.org/10.1186/1746-4811-9-39
高Q，徐W，燕T，方X，曹Q，张Z，丁Z，王Y，王X（2019）拯救植物细胞弹状病毒作为稻飞虱和谷物基因组研究的多功能表达平台。新植物志223:2120–2133。https://doi.org/10.1111/nph.15889
Gelvin SB(2003)农杆菌介导的植物转化:“基因操纵”工具背后的生物学。MMBR 67:16-37。https://doi.org/10.1128/mmbr.67.1.16-37.2003
Khatodia S, Bhatotia K, Passricha N, Khurana SMP, Tuteja N (2016) CRISPR/Cas基因组编辑工具在作物改良中的应用。植物科学7:。https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00506
Kwak S-Y, Lew TTS, Sweeney CJ, Koman VB, Wong MH, Bohmert-Tatarev K, Snell KD, Seo JS, Chua N-H, Strano MS(2019)利用壳聚糖复合物单壁碳纳米管载体在植物叶绿体选择性基因传递和表达。奈米科技14:447-455。https://doi.org/10.1038/s41565-019-0375-4
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Santana I, Wu H, Hu P, Giraldo JP(2020)生物认知motif使植物中的化学货物具有靶向递送纳米材料的能力。Nat Commun 11:。https://doi.org/10.1038/s41467-020-15731-w
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(in chinese with chinese abstract)[王勇，程旭，单强，张勇，刘娟，高超，邱建林(2014)同时编辑三等位基因对六倍体面包小麦的白粉病遗传抗性。纳特生物技术32:947-951。https://doi.org/10.1038/nbt.2969
基因编辑CRISPR蘑菇逃脱了美国的监管。自然532:293 - 293。https://doi.org/10.1038/nature.2016.19754
Zhang H, Demirer GS, Zhang H, Ye T, Goh NS, Aditham AJ, Cunningham FJ, Fan C, Landry MP(2019)成熟植物DNA纳米结构协调基因沉默。美国国家科学院学报116:7543-7548。https://doi.org/10.1073/pnas.1818290116
[朱华，李超，高超(2020)CRISPR-Cas在农业和植物生物技术中的应用。]《细胞生物学》21:661-677。https://doi.org/10.1038/s41580-020-00288-9
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