所有CRISPR所证明出版物那按,质粒在那里，显而易见的是，CRISPR是一个突破性的技术，已经对研究产生了巨大影响，并且很快就会影响我们的日常生活。不仅对各种生物学科产生影响的克里普尔特，基础技术本身不断改善。Cas9变体已被修改为基因组编辑那激活基因表达那可视化基因组基因座,多得多．现在，来自Zhang, jung和Doudna实验室的研究人员已经改进了Cas9核酸酶与工程变异的靶向特异性:eSpCas9那SPCAS9-HF1, & HypaCas9．
非目标问题
众所周知，CRISPR / CAS9基因组编辑可能导致非目标站点的不必要更改．意味着通过CAS9酸酐酶变体，降低CAS9表达和用于靶向的截断GRNA序列，包括降低这些所谓的“偏离目标效应”;但是，这些选项可以很麻烦，可以降低目标效率，有时甚至可以增加偏离目标效果。认识到这些问题，研究人员张实验室当Broad研究所那这Joung实验室在哈佛医学院，还有Doudna Lab.在伯克利举行，通过改变Cas9核酸酶本身的核酸酶活性来减少CRISPR / CAS9的截止目标影响．
eSpCas9的设计与测试
查看Cas9核酸酶的结构（PDB ID：4 oo8和4UN3.)， Slaymaker等假设当目标DNA链分离稳定时Cas9切割效率增加(2那3.）。稳定的绞线分离由2套相互作用维持：
1.非目标股线与Cas9 HNH和Ruvc核酸酶结构域形成的带正电荷槽之间的相互作用
2.靶链和GRNA之间的相互作用（参见下图）
因为偏离靶序列对GRNA具有较少的互补性，因此它们具有更高的改进双螺旋和降低CAS9切割效率的倾向。但是，这并不总是足以让偏离目标站点被削减。Slaymaker等人推出，如果它们在HNH / Ruvc槽中的正电荷降低，则它们可以削弱凹槽与带负电荷的DNA之间的相互作用，因此使基底束分离稳定。这种降低的股线分离与在非靶位点的GRNA结合所提供的弱分离将理论上降低偏离靶切割。
为了降低HNH/RuvC沟槽的电正性，Slaymaker等人在32个单独的Cas9突变体的沟槽中进行了各种丙氨酸替换。当测试他们的切割能力时EMX1在人类胚胎肾(HEK)细胞中，这些初始突变体中有11个保留了wt Cas9的靶上活性，而在已知的脱靶位点上降低了脱靶活性。作者继续结合这些最好的突变，并测试了组合突变在HEK细胞的多个基因组位置上的靶上和靶外活性。进一步检测两个突变体，SpCas9(K855A)和eSpCas9 (1.1)，然后是一种检测基因组双链断裂的技术（祝福）揭示这些突变体不会在意外的位点导致脱靶效果，并且如预测的那样，降低了基因组的偏离目标效果。
Slaymaker等人的进一步研究表明，这些突变体对HEK细胞没有毒性，类似的突变可以提高特异性Cas9来自S.金黄色葡萄球菌．这意味着您可能对您的CAS9同性恋者施加类似的合理突变并得到改善的目标特异性。
SPCAS9-HF1的设计与测试
kleinstver等人和jung实验室同样认为，如果他们可以削弱Cas9和DNA之间的序列独立相互作用，那么他们就可以减少脱靶切割(4.）。然而，而不是在非目标股线和Cas9中使用的相互作用弱化，而不是弱化相互作用，kleinstver等人通过突变N497A、R661A、Q695A和Q926A (SpCas9-HF1包含所有四种突变)破坏Cas9与目标DNA链磷酸盐骨干之间的相互作用。尽管精确突变与eSpCas9中发现的不同，但对特异性的影响是相似的;与WT SpCas9相比，SpCas9- hf1在多个基因组位点上产生的脱靶剪切更少。
对Cas9动态结构的了解导致了HypaCas9的开发
研究人员在Doudna Lab.在伯克利最近添加了自己的忧郁呃一种准确的Cas9变体(HypaCas9)到增强CRISPR工具池。在他们的工作,Chen et al. 2017使用单分子FRET测量来确定CAS9的哪个部分对于核酸酶特异性可能是重要的。他们发现ESPCAS9（1.1）和SPCAS9-HF1在与靶位点结合后以无活性形式倒置，并提出这种停滞导致其增强的特异性。额外的工作表明，移动REC3领域中的突变促进了这种摊位。通过这种新的发现结构知识，与Joung实验室合作，他们使用了目标诱变来创造HypaCas9（SPCAS9 N692A / M694A / Q695A / H698A）。这个新的变体显示类似的目标活动和在测试时的网站上类似或减少偏离目标活动比较的到ESPCAS9（1.1）和SPCAS9-HF1。
Cas蛋白的未来可能性
凭着增强的特异性，eSpCas9那SPCAS9-HF1，而HypaCas9应该能够使研究人员哺乳动物细胞的精确编辑并且可以减少对应用和/或治疗环境中脱靶效应的担忧。将这些伟大工具中发现的不同突变结合起来会进一步增强基因组编辑的特异性吗?我们希望你们中的一个能很快回答这个问题!我们期待看到研究界如何利用这些工具，并对基因组工程的持续改进感到兴奋!
参考文献
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