在2013年的夏天，一篇引人注目的9篇论文描述了CRISPR/Cas9基因组工程方法秀丽隐杆线虫的发布，标志着一个新时代的到来秀丽隐杆线虫研究。同源定向修复（HDR），它可以插入定制的基因组修饰，在线虫中非常强大，hdr介导的修饰方法也在不断改进。新工作鲍勃·戈尔茨坦实验室北卡罗来那大学在C.Reaves中使用CRISPR更容易——现在，可以在一个注射步骤中产生荧光蛋白融合、转录报告和功能性等位基因丢失。整个方案约需2-3周，但实际操作时间不足8小时。
创建一个模块化的，基于选择的基因标记方法
多个特征秀丽隐杆线虫使CRISPR/Cas9在该物种中如此成功，即上面提到的健壮的HDR，一个可接近的种系，和多个可选择的标记。鲍勃·戈尔茨坦的实验室之前使用了转基因选择策略秀丽隐杆线虫/CRISPR实验，但这种策略需要使用不健康、难以注射的药物unc-119（ed3）动物，以及第二个注射步骤，以删除选择标记。其他实验室已经使用基于PCR的筛选来检测突变，但这种方法将筛选限制在几百种蠕虫，这使得罕见事件的检测变得困难。
Dickinson等人试图创建一种新的、高效的基于CRISPR/Cas9选择的方法，以在任何遗传背景上产生敲入。他们的新方法使用了一个包含抗潮霉素和滚筒运动表型基因的选择盒(观看下面的视频，看看滚筒运动表型的作用!)为了使这些标记在注射后易于去除，他们添加了侧翼loxP位点和热休克诱导Cre来产生自切除盒(SEC)。
电影来自Dickinson等人显示Rol表型。移除SEC病例后，右侧显示Rol表型的动物较少。经美国遗传学协会许可使用。
使荧光标记蛋白质成为可能秀丽隐杆线虫，他们将SEC插入荧光蛋白（FP）和3xFLAG标签之间的合成内含子中（见下面的构造示意图）。自我切除后，产生的loxP疤痕位于该合成内含子中，并且只有荧光蛋白和3xFLAG标签序列插入基因组。
来自Dickinson等人的自切除盒式磁带示意图。经美国遗传学协会许可使用。
为了使用这个基于sec的系统，首先设计和克隆你感兴趣的基因的500-700 bp同源臂到FP-SEC载体使用吉布森组装。这个构造将作为修复模板质粒产生荧光和3xFLAG标记融合蛋白。
然后将修复模板和Cas9-sgRNA质粒注射到幼虫的生殖系中。一旦蠕虫产卵后，就会向培养皿中加入潮霉素，以选择可能的撞击因子。这些候选动物可以根据它们的Roller表型进一步筛选。如果SEC被插入到基因的5 '末端，SEC将目标基因从启动子中分离出来，创造一个功能缺失的等位基因以及感兴趣基因的启动子- fp融合。然后对这些菌株的L1/L2幼虫进行热休克去除SEC，在生长5-6天后，根据Roller表型的损失，筛选已切除SEC的野生型动物。这些动物含有与目标基因相融合的荧光蛋白。
经过初步测试，Dickinson等人在7个基因上平行测试了该系统;当他们给每个基因注射60-80只动物时，他们第一次尝试就获得了6/7个基因。数据很清楚——基于sec的系统使用简单，效率很高秀丽隐杆线虫基因组改造。
来自Dickinson等人的示意图说明了用荧光标记线虫蛋白的步骤。以his-72轨迹为例。经美国遗传学协会许可使用。
本系统的应用
Dickinson等人开发了一个模块化系统，它只需要很少的动手劳动，并且可以方便地标记蛋白质中的每一种蛋白质秀丽隐杆线虫基因组尽管他们测试了荧光蛋白融合，但该系统可用于进行许多其他基因组修饰，包括靶向突变。基于SEC的系统可能在其他物种或细胞培养中有效。除了CRISPR/Cas9应用之外，SEC选择还可以取代其他限制性更强的应用秀丽隐杆线虫可选择标记系统。这种新颖、快速、用户友好的系统代表了CRISPR/Cas9革命的又一次飞跃！
工具书类
流线型基因组工程与自切药物选择盒。狄金森DJ、帕尼·阿姆、赫佩特·JK、希金斯CD、戈尔茨坦B.遗传学。2015年6月3日。pii:genetics.115.178335。[打印前的Epub]PubMed。
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秀丽隐杆线虫CRISPR/Cas9编辑的其他策略:
利用Cas9工程秀丽隐杆线虫基因组触发同源重组。Dickinson DJ，Ward JD，Reiner DJ，Goldstein B.Nat方法。2013年10月；10(10):1028-34. 内政部：10.1038/nmeth.2641。Epub 2013年9月1日。PubMed。
从本出版物中找到质粒Addgene。
利用与秀丽隐杆线虫Cas9位点微同源的线性DNA进行可伸缩和多功能基因组编辑。Paix A，Wang Y，Smith HE，Lee CY，Calidas D，Lu T，Smith J，Schmidt H，Krause MW，Seydoux G.遗传学。2014年12月；198(4):1347-56. 内政部：10.1534/genetics.114.170423。Epub 2014年9月23日。PubMed。
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