CRISPR-Cas9基因组编辑可能是当前基因表达调控的新方法，但其他基因调控系统对生物学仍有价值。creo -lox重组是20世纪80年代发现的在时空上调控基因表达的重要方法之一在活的有机体内模型，新的基于creo -lox的技术今天仍在开发中。在这篇文章中，我将重点介绍Brainbow多色标签系统的发展——这是creo -lox持续使用的一个完美例子。看看我们之前的博客，质粒101:Cre-lox，如果你需要一个关于creo -lox重组如何工作的快速入门。
crex -lox重组的研究进展包括诱导Cre，如他莫昔芬应答CreERT, crex -lox与FLP-FRT重组耦合以产生额外的重组事件，以及合成替代loxP位点以指定不同的重组模式。在2007年,乔舒亚•赛恩斯哈佛大学分子和细胞生物学系的Jeff Lichtman利用了creo -lox的这些特性，创造了Brainbow小鼠神经标记系统。Brainbow-1和-2已经被进一步改进为Brainbow 3.2。在斑马鱼和果蝇等其他系统中，脑虹标记也被应用于细胞标记和谱系追踪。
为什么大脑彩虹?
Brainbow强调了生物学中单细胞分辨率成像的趋势。Sanes和Lichtman试图绘制一幅大脑的地图，一幅连接体，它将详细说明神经元如何形成回路以及它们的突触在哪里。查看概览原理图在这篇文章的底部来了解Brainbow系统之间的差异。前脑弓技术，如高尔基染色，扩散标签注射，或染色切片的电子显微镜，由于低分辨率或非常耗时，需要发展一种新技术。在像大脑一样紧密排列和交织的结构中，强大的单细胞标记对于区分单个细胞是必要的。
的大脑彩虹- 1.0构造含有三种荧光蛋白:RFP(红色金宝搏app下载)、YFP(黄色)和M-CFP(膜系青色)。没有Cre重组，RFP得以表达。Cre可以介导两个缺失中的一个，从而允许YFP或M-CFP表达;这些删除使用2个loxP变体定义(只有相同的loxP站点可以介导重组)。这些删除是互斥的，因为任何一个删除都会删除另一个loxP站点变体，从而阻止进一步的重组。Brainbow-1.1将系统扩大到四种荧光蛋白，由三种loxP变体指定重组事件，但金宝搏app下载原理保持不变。该结构中的第一个荧光蛋白OFP(橙色)在Cre缺失时表达;随机Cre切除可导致三种重组之一，随后的重组不能发生。
Brainbow-1系统采用了cre介导的缺失，Brainbow-2.1的设计巧妙地结合了cre介导的缺失和倒置。的大脑彩虹- 2.1构造可以表达四种颜色之一(n-GFP, RFP, YFP或M-CFP)。该结构包含两个串联的可逆片段，每个片段都有两个相反方向的荧光蛋白编码序列。cre介导的切除去除了一个片段，消除了两种颜色的可能性。只要仍有Cre表达，其余的盒体就可以反转;一旦Cre从系统中去除，编码序列最接近启动子的荧光蛋白就会被表达。该系统与Brainbow-1.0的不同之处在于，需要瞬态Cre重组来防止结构的恒定反转。
Sanes和Lichtman使用原核注射将这些Brainbow结构体植入小鼠体内。当他们对老鼠大脑成像时，他们发现了超过3-4种颜色，这是由于该结构的多个副本串联整合(Brainbow-1.0小鼠中约有8种)。多个独立的重组事件的组合效应导致了彩虹般的颜色。有了三份这种结构，人们会期望有十种颜色(见右表);在各种报告中，Sanes和Lichtman观察到由于较高的拷贝数，90-160种不同的颜色。Brainbow这个名字非常适合这种多彩的技术。
优化系统:Brainbow-3
尽管Brainbow为神经科学家提供了标记单个神经元所需的大量颜色，但该系统也存在一些局限性。首先，由于荧光团的光不稳定性以及荧光团在神经元体中聚集的趋势导致的低荧光强度，Brainbow小鼠组织的成像具有挑战性。其次，该系统不允许免疫染色分析。虽然使用的荧光团是不同的荧光，它们的蛋白质序列是高度同源的，阻止了针对每个荧光团的特异性抗体的设计。第三，Brainbow-1和Brainbow-2都包含一个“默认”状态;例如，Brainbow-1.0在未进行重组的情况下表达RFP。大多数神经元不成比例地表达这种默认状态，限制了在一个特定区域可以观察到的不同颜色的数量。
在2013年,蔡道文，等。发布了Brainbow技术的改进版大脑彩虹- 3.0，目标是克服上面列出的限制。首先，他们筛选了各种荧光蛋白，寻找那些具有理想特性(低聚集、高光稳定金宝搏app下载性、固定后高稳定性)的蛋白。从这7种蛋白质中，他们选择了3种荧光和序列重叠水平较低的蛋白质(珊瑚mOrange2、水母EGFP和海葵mKate2)。然后，他们成功地为每种蛋白质生成了定制抗体，并确认它们没有交叉反应，为免疫染色分析打开了大门。为了实现均匀的细胞标记，他们生成了荧光蛋白的法尼化衍生物，这些衍生物直接被运输到细胞膜上。金宝搏app下载法尼基化衍生物的膜运输可以标记精细的轴突和树突，这在Brainbow-1和-2之前是不可见的。
Brainbow-3.0保留了Brainbow-1.0的一般结构，但以mOrange2、EGFP和mKate2为荧光团;mOrange2是默认状态。相比之下,大脑彩虹- 3.1和-3.2由于在启动子之后立即添加了翻译阻断STOP盒，因此不显示默认荧光。STOP盒包括一个不发荧光的突变YFP，但可以通过免疫染色检测到。这一特性有助于筛选crea阴性的Brainbow小鼠，以确定表达该构建物的细胞数量和类型。由于添加了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)， Brainbow-3.2的光稳定性得到了改善，WPRE通常用于提高转基因蛋白水平。
Brainbow系统之间的变化概述
脑弓的变种和应用超越了老鼠的大脑
除了改进Brainbow系统，Sanes和Lichtman还开发了一个互补的系统Flpbow构造其功能与基于creat的Brainbow相似，但受FLP/FRT重组酶控制。当放置在不同启动子下时，Brainbow和Flpbow可以用来标记不同的细胞群。
为了减少使用Brainbow转基因和Cre所必需的动物繁殖，Cai等人还创建了一个Autobow构造包含Cre和XFPs。Cre的产生驱动重组和XFP选择，然后Cre自我切除。这些结构至少可以稳定地维持六代。
除了神经元pThy1-Brainbow构造， Addgene也有两个Brainbow腺相关病毒载体(AAV)可用-188完整比分直播AAV-EF1a-BbChT和AAV-EF1a-BbTagBY．由于AAV的大小限制，这些结构包含两个XFPs;同时感染这两种结构会产生至少8种颜色。AAV的使用提供了空间和时间控制，而不需要生殖系修饰，使Brainbow可以用于多种物种。
更多的变种已经由其他实验室创造，包括r26r -五彩纸屑Hugo J. Snippert等人(2010)以及MAGIC Marker策略Karine Loulier等(2014)．
目前，Brainbow技术还被用于研究果蝇、斑马鱼等模型生物。果蝇的脑弓有助于绘制神经回路，比如运动神经元和神经肌肉连接处之间的连接。在斑马鱼中，这种方法在谱系追踪中变得非常有用;用“斑马线”追踪角膜上皮的发育。
对于对神经科学和发展感兴趣的科学家来说，Brainbow是一个很有价值的工具来标记和跟踪单细胞，因为它的广泛的阵列和高稳定性的颜色。Sanes和Lichtman估计Brainbow的彩色标记至少在一个数量级上减少了给定大脑区域的映射时间。很明显，脑弓技术的进一步改进将为研究大脑和其他生物系统的复杂物理组织提供重要的见解。
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引用:
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