这篇文章是由哈佛大学神经科学博士研究生Krissy Lyon撰写的。
就像电脑、手机和汽车在技术上越来越先进，让以前的版本过时一样，我们在实验室使用的技术也被既节省时间又节省金钱的改进版本所取代。然而，无论你是在阅读经典论文还是在头脑风暴新的技术创新，历史技术知识都会派上用场。让我们来看看三种历史技术:southern blotting, restriction mapping，测序凝胶，以及它们的现代对等物，看看我们能从它们的进化中学到什么。
Southern blotting和quantitative real-time PCR
以其发明者爱德华·m·南方命名(1)，可用于检测DNA的身份、大小和丰度。如果科学家想知道一个有机体是否有特定的基因突变，southern blotting可以用来确定突变基因的存在。在southern blotting中，DNA被分割成更小的片段，在凝胶上跑步，并通过放射性或荧光标记探针杂交转移到膜上进行分析。如果DNA与探针是互补的(例如，具有研究人员正在寻找的突变基因的序列)，那么探针将与样品结合，从而标记它。标签可以通过放射性标记探针的自放射照相和x射线胶片显示，或者通过荧光标记探针的荧光存在来显示。基于比色法和发光法的检测方法也常用。在所有情况下，结果都可以通过与控制样本比较的信号强度来量化。
Southern blotting的应用范围从确认结果克隆或者对法医和临床诊断进行敲除实验。southern blotting用于识别基因突变的一个例子是用于镰状细胞性贫血(2）.Southern blotting，结合限制性消化分析，被用来识别导致镰状细胞贫血的突变β珠蛋白基因的存在。突变破坏了限制性内切酶MstII识别的序列。当用MstII限制性消化和southern blotting对来自没有镰状细胞贫血的个体的样本进行时，两个DNA片段被观察到，因为DNA有MstII剪切的位置。在镰状细胞贫血患者中，这种酶不能切割DNA，因此只能观察到一个DNA片段。
今天，Southern blotting在很大程度上已经被实时PCR所取代，来回答同样的实验问题。实时PCR通过在整个扩增过程中记录DNA丰度来检测和量化感兴趣的基因或DNA序列，而不仅仅是在最后标准的聚合酶链反应．这使得研究人员可以比较不同的DNA序列，以确定样本中哪个序列更丰富。而Southern blotting是劳动密集型的，需要大量高质量的DNA, real-time PCR有几个优点，包括更容易自动化，更高的通量筛选，和较低的DNA用量要求，节省研究人员的时间和资源(3.）.尽管如此，转基因动物的研究人员可能会选择Southern blotting来筛选插入转基因的方正转基因动物，因为Southern blotting的假阳性率低于实时PCR (4）.
限制绘图和现代测序
通过使用限制性内切酶在特定位点切割DNA (5）.假设你有一个未知序列的基因组。在测序普及之前，研究人员使用限制性内切酶图谱，通过比较不同限制性内切酶酶切产生的片段来研究DNA序列的内容。用限制性内切酶孵育未知序列的DNA样本，然后在琼脂糖凝胶上运行这些产品，允许研究人员正确定位感兴趣的DNA序列的特定片段，以创建DNA的物理地图。从20世纪70年代开始，限制图谱被广泛用于DNA图谱和基因组检测(6）.通过这些实验获得的知识使研究人员能够确定基因的位置。有了这些知识，研究人员就能够针对特定的基因进行删除，从而研究它们的功能。这种研究DNA序列的方法在测序尚处于发展初期的时候帮助了研究人员。今天，研究人员使用Sanger和下一代测序技术来回答类似的实验问题(见下文)。
重要的是，尽管限制性内切酶的作用已经改变，但它们肯定还没有死!实验室仍然保留着限制酶用于克隆和分析摘要．研究员可以测试插入的方向只有几个小时以低成本限制映射(图1)。尽管一些实验室可能更喜欢发送DNA直接测序(下图),限制映射可能仍然被用来屏幕多个殖民地之前选择一个更小的子集序列。
测序凝胶和下一代测序技术
桑格测序(Sanger sequencing)于1977年问世，又称链端测序或双脱氧测序，是确定一串DNA中核苷酸顺序的重大突破(7）.桑格测序使用被称为双脱氧核苷酸(ddNTPs)的改良核苷酸，这种核苷酸缺乏DNA链延伸所需的3 '羟基(8）.在合成反应中加入少量放射性标记的ddNTP和所有四个常规核苷酸，会合成所有可能长度的DNA链，因为添加ddNTP后，延伸就终止了。研究人员进行了四种不同的反应，每一种反应对应一种放射性标记的ddNTP，然后将这些反应在凝胶的不同通道中进行。由于测序凝胶将根据大小分离DNA，根据添加ddNTP的日期和时间，最终生成的凝胶应该包含与DNA序列中的每个核苷酸相对应的放射性带。然后，研究人员(或简单的计算机程序)就可以编译给定核苷酸的身份和位置复制DNA序列(图2)。
桑格测序的准确性和可获得性导致了桑格测序的广泛应用。在这项技术的基础上，放射性标记的核苷酸被荧光标记的核苷酸所取代，从而可以进行荧光检测。这种测序速度的提高最终导致了一般认为的第一代DNA测序机(9）.今天，类似的技术，有时被称为序列DNA，因为它是通过电子记录荧光的荧光标记核苷酸的活性合成的，这种方法被称为焦磷酸测序．
对更快、更高通量和更便宜测序的推动推动了测序革命，这一革命仍然盛行。全基因组测序或转录组分析(RNAseq)需要一次对多个样本进行测序，以便以后进行比较。这些下一代测序技术通常不依赖于Sanger测序，而是使用焦糖测序这样的方法，这种方法可以同时对数千个reads进行并行测序。测序的其他应用，如确认克隆实验的结果，只需要一个或几个测序反应，可以使用Sanger测序。
展望未来
Southern blotting, restriction mapping and sequencing gel是许多开创性科学发现的经典技术(5，8）.虽然较新的技术已经在很大程度上取代了这些技术，但这些技术仍然具有有用的应用，并为许多当前技术提供了信息。例如，限制性映射导致了重组DNA技术，这在实验室中是常见的。
随着科学技术的迅速发展，我们现在使用的一些常见的实验室技术可能很快就会过时。例如，流行的基因组工程工具，CRISPR也许有一天，可以利用技术来产生转基因小鼠，如BAC转基因或传统的敲除/敲除，成为过去。在测序领域，一个即将到来的创新是基于纳米孔的DNA测序，它通过测量核苷酸的不同电化学性质引起的离子流差异来读取DNA链通过一个微小孔时的核苷酸(8）.与较老的技术相比，基于纳米孔的DNA测序仪相对较小，这意味着DNA测序可以从测序核心转移到单个实验室，甚至到现场。目前的版本已经在商业上可用，尽管据报道它们有很高的错误率(10）.预计基于纳米孔的测序技术有一天可以以低于1000美元的价格对整个基因组进行测序(10）.测序的未来应该带来高效、低成本、快速、准确地对大量DNA进行测序的方法。
随着时间的推移和研究的进展，我们肯定会看到各种生物技术的许多改进。这将为世界各地的生物学家带来更快、更高的产量和可能更精确的技术。请在下面的评论区告诉我们你最喜欢的“历史实验室技术”!
非常感谢我们的客座博主Krissy Lyon!
克里斯·里昂是哈佛大学神经科学博士候选人，目前正在研究5 -羟色胺能系统和行为。
参考文献
1.南部,埃德温Mellor。用凝胶电泳分离的DNA片段中特定序列的检测分子生物学杂志98.3(1975): 503 - 517。PubMedPMID:1195397．
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参考资料在Addgene博客188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
主题:分子生物学协议和提示，质粒
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