扩展腺嘌呤基础编辑器的目标范围和编辑效率

大卫刘的实验室创造了第一个基本编辑器2016年（Komor等，2016年），从那时起一直试图扩展他们的精确编辑能力。基础编辑器使得特异性DNA碱改变，并由融合到DNA改性酶的催化受损的CAS蛋白（DCAS或CA酸酐）组成，在这种情况下是脱氨酶。来自C•G-TO-T•A的基础变化由胞嘧啶基础编辑器（CBE）介导，并且由A•T-To-G•C的基本变化由Adenine基础编辑器（ABES）介绍。这是如何运作的？通过分子生物学团队合作。引导RNA（GRNA）指定DNA上的编辑靶位点，CAS结构域将改性酶引导至靶位部位，并且脱氨酸酶诱导DNA碱基变化而不进行DNA双链断裂。但基础编辑并不完美。它们可能很慢，只能针对某些网站，或仅制造基替代的子集。

需要速度：CAS前的基本编辑让我们走

图1：大卫刘举行了细胞讨论会的谈话：基于基因和基于细胞的疗法：Crispr，干细胞，及时在本月早些时候会议。

为基础编辑器产生的另一个问题是编辑域必须在CAS域放开DNA之前引起基本变化。ABES有些缓慢并且需要强大的CAS9域以“保持”长度足以使DNA引起基础变化。因此，ABES只与SPCAS9之外的许多CAS域略微兼容。为了扩展基因编辑应用和eBES的靶向范围大卫刘的实验室出发，以增加对CAS同源物的兼容性增加。

在噬菌体的帮助下发展更好的基础编辑器！

来自刘实验室的最新ABE是ABE7.10其中含有脱氧腺苷脱氨素酶，TADA-7.10（Gaudelli等，2017）。这个想法是通过更快的脱胺率来发展TADA-7.10版本，以便在CAS同源物放开之前，可以发生脱胺。刘实验室开发了噬菌体辅助连续演进（速度）和噬菌体辅助非连续演进（PANCE）选择系统，更好，更快的APES（图2）。这些系统允许通过许多突变，选择和每天复制来快速连续蛋白质演进。

速度和PANCE系统使用M13噬菌体，依赖于基因III的表达来产生传染性颗粒。细菌中基于质粒的基于质粒遗传循环将GENE III的表达与基础编辑器活动和编辑速度的表达联系起来，包括以下组件：

• 表达DCAS9的宿主细菌中的质粒
• 宿主细菌中的质粒表达基因III。基因III在T7 RNA聚合酶的控制下，不能表达，直到基础编辑器校正T7 RNAP内的早期停止密码子。
• 编码Deaminase TADA-7.10的噬菌体
• 控制噬菌体突变率的诱变质粒

噬菌体感染导致完整的ABE蛋白质。如果噬菌体提供基本编辑器的活性变体，则产生官能基因III产物，并且可以感染细菌细胞。如果噬菌体不提供活性变体，则噬菌体不传染性。编辑速度决定了哪种噬菌体变体可以比稀释速率更快地传播（从感染到新鲜的未感染的宿主细胞培养的通过通道）。该稀释步骤代表了速度和PANCE之间的主要差异：对于PANCE，噬菌体后代不会稀释，但是从受感染的宿主细胞培养物手动被传递给未感染的培养物，导致整体稀释且严格的噬菌体选择较少。

图2：噬菌体辅助演化的基础编辑活动。细菌中基于质粒的基于质粒遗传循环将基因III的表达与基础编辑活动和编辑速度的表达联系起来。

介绍ABE8E - 快速灵活的adenine基础编辑器

低严格的PANCE，之后是较高的严格性速度，导致与原始TADA-7.10酶相比具有更高的基础编辑活动的TADA变体的演变。在测试众多TADA变体之后，它们识别了TADA-8E，其比TADA-7.10更快地编辑590倍。它与所有CAS9和CAS12同源物兼容，其中研究人员在包括SPCAS9，SACAS9，LBCAS12A，ENASCA12A，SPCAS9-NG，SACAS9-KKH，CP1028-SPCAS9和CP1041-SPCAS9。这生成的基础编辑器被命名为abe8e。ABE8E不仅快速，它也可以复用：当任务纠正妨碍胎儿血红蛋白基因表达的两个点突变时，ABE8E同时变化，效率为54％，比abe7.10高约7倍。

然而，ABE8E的编辑速度和靶向范围的增加具有代价：ABE8E显示出增加的偏移DNA和偏离目标RNA活性。为了缓解该缺点，实验室将额外的突变（V106W）引入TADA-8E，得到的ABE8E（TADA-8E V106W）在靶向DNA中作为ABE8E的较高效率，同时保持下靶DNA下降和关闭 -ABE7.10的目标RNA编辑率。

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为什么工程师和优化基础编辑器？

天然存在的酶和功能域的有针对性的演化加速了能够进行更快，更精确的基础编辑器的开发，能够编辑以前不可认定的序列。四个DNA碱基渗透，所以称为C至T，G至A，A至G和T至C的点突变代表了已知致病点突变的三分之二。在一起，胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑器可以纠正所有四种点突变，理论上将疾病相关版本转化为野生型版本。随着ABE8E的添加到基本编辑工具箱，科学家们现在可以更有效地制作这些编辑，并在更多的环境中更有效。

参考

Gaudelli NM，Komor Ac，Rees Ha，Packer Ms，Badran啊，Bryson di，Liu Dr（2017）在没有DNA裂解的基因组DNA中的A•T至G•C的可编程基础编辑。自然551：464-471。https://doi.org/10.1038/nature24644

Richter MF，赵克，伊顿E，罗布纳石A，Newby Ga，Thuronyi BW，Wilson C，Koblan LW，Zeng J，Bauer de，Doudna Ja，Liu Dr（2020）舞曲底座编辑器的噬菌体辅助演进与改进的CAS域兼容性和活动。自然生物技术。https://doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z.

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