用SHERLOCK和DETECTR找到核酸

最初发布于2018年8月30日，更新于2020年4月16日。

灵敏和特异的核酸检测对临床诊断、基因分型和生物技术进步至关重要。然而，许多核酸检测方法要么缺乏检测低浓度核酸的敏感性或特异性，要么过于昂贵、耗时和复杂，难以在标准实验室之外使用。在COVID-19大流行的情况下，qPCR可用于诊断SARS-CoV-2 RNA的存在，但试剂和设备的获取不足已成为一个瓶颈。

在过去的几年里，科学家们利用了CRISPR-Cas9蛋白变体，Cas13,Cas12a开发简单、便携、廉价的平台，在原子水平上可靠地检测核酸。

的张实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化的方法称为特异性高灵敏度酶促报告基因解锁(《神探夏洛克》和SHERLOCKv2） (古滕贝格等人，2017年和2018年)．而Doudna实验室已经使用Cas12a的非特异性ssDNA降解开发了称为DNA内切酶靶向CRISPR反式记者(DETECTR) (陈等，2018）.

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA的混杂切割和降解，来切割和激活一个报告基因。从这个报告中可以检测到的信号可以被测量和量化，以确定DNA、RNA或感兴趣的突变的存在和数量。SHERLOCK和DETECTR一起展示了基于crispr的诊断功能。

SHERLOCK-特异性高灵敏度酶报告解锁

Cas13 (C2c2)于2016年首次被发现作为RNA引导的RNA酶(Abudayyeh等人2016年）．Cas13可以在单个CRISPR RNA (crRNA)的引导下剪切ssRNA或mRNA。它还展示了非特异性ssRNA切割的“附带效应”。

夏洛克是怎么运作的?

Cas13可以与crRNA一起编程，以靶向感兴趣的ssRNA，例如，特定于病毒或病原体的序列。一旦Cas13识别并与程序化的序列结合，它就可以随意地切割周围的ssRNA分子。在SHERLOCK中，一个熄灭的荧光ssRNA报告被添加到反应中。被激活的Cas13裂解的荧光RNA会产生一个可量化的信号，表明你的目标核酸的存在。为了提高检测的灵敏度，首先使用RPA(重组酶聚合酶扩增)或逆转录酶(RT)-RPA对样本中的目标DNA或RNA进行扩增。RPA与T7转录结合，将扩增的DNA转化为RNA，随后由Cas13检测。此扩增步骤与ssRNA报告相结合，使SHERLOCK能够以原子灵敏度和单碱基对错配特异性检测DNA或RNA。

SHERLOCKv2

SHERLOCK在2017年首次推出时存在一些局限性，所以实验室做了进一步的修改，以改进他们的检测系统。他们给这个系统命名SHERLOCKv2《神探夏洛克》第二版。以下是一些改进:

• SHERLOCKv2在预扩增步骤中使用的引物少得多，允许在不影响灵敏度的情况下进行更大的定量。
• 为了在一个反应中检测多个目标，我们将Cas酶，如Cas13和Cas12a的变化，与每种酶的不同荧光报告相结合。
• 此外，CRISPR iii型效应核酸酶Csm6可以与Cas13结合扩增单个靶标的信号。Csm6可以剪切与感兴趣的crRNA互补的ssRNA(Niewoehner和Jinek, 2016)，并且很容易被Cas13 ssRNA切割副产物激活。因此，Cas13与感兴趣的程序化区域的结合将导致Cas13特异性报告基因的分裂和Csm6的激活。Zhang实验室的研究表明，通过添加Csm6和Csm6特异性报告基因(与Cas13报告基因在同一荧光通道中)，他们可以显著放大单个靶标的检测信号。
• 对SHERLOCKv2进行了改造，使裂开的报告器可以在商业的横向流动条带上检测到，类似于怀孕测试。在横向流动的条带中，你的DNA或RNA在给定样本中的存在只是由条带上的条带数量决定的。这种类型的读数允许核酸检测几乎任何地方，横向流动条易于运输和工作迅速，提供可靠的结果，在短短一个小时。

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SHERLOCK检测系统的应用

Zhang实验室证明，SHERLOCK可以可靠地区分来自多个样本来源的寨卡病毒和一种密切相关的病毒登革热。SHERLOCK还可以从无细胞DNA片段中检测低频癌症突变，以及从人类唾液中检测与健康相关的单核苷酸多态性(SNPs)。

SHERLOCKv2提供了一种检测核酸的方法，具有高灵敏度和特异性，且不影响速度、易用性和便携性。该方法可用于一系列应用，包括临床诊断(如病原体或病毒检测)、治疗和敏感基因分型。SHERLOCK系统的美妙之处在于它可以在实验室和现场使用方便有效(Myhrvold等人，2018)。

现在，张的实验室共享了使用SHERLOCK检测SARS-CoV-2 RNA的协议．该测试使用从患者样本中纯化的RNA开始，可以在一小时内用试纸读取。而实验室指出目前方案还没有被批准用于临床他们希望该协议能成为推进诊断的平台。

DETECTR- DNA内切酶靶向CRISPR Trans报告

Cas12a (Cpf1)是CRISPR Cas的变体也能像Cas9一样切割dsDNA（Zetsche et al.， 2015）.Cas12a识别不同的PAM位点，在dsDNA断裂后产生5 '和3 '交错端。杜德纳实验室发现Cas12a具有非特异性(反式)，并利用这种能力创建了一个名为DETECTR．

探测器是如何工作的?

DETECTR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列，如人类乳头瘤病毒(HPV)基因组。一个ssDNA荧光猝灭(FQ)报告因子被加入到反应中，当ssDNA被降解时，它将产生一个信号。为了提高灵敏度，首先采用RPA等温扩增技术扩增DNA。当Cas12a- crna碱基对与感兴趣的dsDNA配对时，Cas12a的dna酶活性被启动。周围反式-包括ssDNA- fq报告细胞在内的ssDNA随后以每秒约1250次切割的速度降解。一个可量化的荧光信号表明你感兴趣的DNA的存在，在这个例子中是HPV。

作为概念的证明，该实验室证明，DETECTR可以在一个小时内在原子水平上准确地从人类细胞中区分出两种相似类型的HPV, HPV16和HPV18。因此，DETECTR能够从患者样本中快速、高选择性和高灵敏度地检测核酸。

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DETECTR在诊断中的应用

DETECTR可以简单有效地检测混合人群中的核酸，用于一系列分子和临床诊断应用。该公司庞大的生物科学已经在DETECTR技术的基础上启动，其任务是“提供一个基于crispr的平台，在此基础上可以进行无限数量的生物传感测试”。

猛犸生物科学和UCSF最近的合作采用DETECTR平台检测SARS-CoV-2采用横向流条格式。他们发表在自然生物技术．与SHERLOCK检测系统一样，DETECTR还没有被批准用于诊断，但正在进行验证研究。

Jennifer Tsang对本文的更新做出了贡献。

参考文献

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