FLEx技术和光遗传学:以高时空分辨率打开基因表达的开关

光遗传学:用光控制神经元

2005年，由斯坦福大学神经生物学家领导的一个小组卡尔·戴瑟罗斯一项新技术诞生了，“光遗传学”这个术语也被创造出来(Boyden et al.， 2005;Deisseroth et al.， 2006)。

尽管光遗传学的发展相对较晚，但它的历史始于近50年前发现的微生物视紫红质，即吸收光子进行能量转换或诱导细胞内或细胞间信号通路的光敏蛋白质(Ernst et al.， 2014)。微生物视紫红质由视色素基因编码，包括细菌视紫红质、盐视紫红质和通道视紫红质古生菌第三位是绿藻(Oesterhelt and Stoeckenius, 1971;松野八木和Mukohata, 1977年;福斯特等人，1984年;Harz和Hegemann, 1991)。这些蛋白质控制着细胞膜上的电荷流动，并在可见光下维持膜电位(Zhang et al.， 2011)。

微生物的视紫红质和神经元有什么共同之处?神经元刺激是由穿过轴突膜的离子运动触发的:一旦一定数量的正离子穿过细胞膜，就会达到一个阈值，神经元就会发出信号，沿轴突向下传递(Lodish et al.， 2000)。大部分大脑神经元都不是自然感光,所以视蛋白基因的选择性表达目标细胞可以控制神经活动与一个特异性远远大于可以通过使用药物或电生理方法(戴瑟罗斯,2011;Mei and Zhang, 2012;Towne et al.， 2016)。

光遗传神经调节是通过光线实现的:当受到正确波长的照射时，微生物的视紫红质使离子能够穿过轴突的膜，从而控制神经活动(Bernstein and Boyden, 2011;梅和张，2012)。例如，蓝光激活通道视紫红质，进而触发神经兴奋，而黄光激活盐视紫红质以沉默神经元活动(图1)(Wiegert et al.， 2017)。

如何让视蛋白进入大脑

为了在大脑中表达视蛋白，研究人员将编码微生物视紫红质的基因修饰病毒注射到特定的大脑区域。随后，通过直接植入注射部位并连接到激光的光纤套管，对病毒感染的神经元进行光刺激。激光闪烁特定波长的光，选择性地打开或关闭神经元活动(Atasoy et al.， 2008;泰勒等人，2016;Hooper and Maguire, 2016)。

重组腺相关病毒(rAAVs)由于其相对稳定的染色体外长期表达和低诱导先天性免疫应答的能力，在中枢神经系统的基因传递中越来越受欢迎(Fenno et al.， 2011)。然而，rAAVs缺乏特异性感染定义的神经元亚群的能力，这是光遗传学的一个主要缺点(Belzung et al.， 2014)。这可以通过将视蛋白基因与细胞类型特异性启动子融合来克服;然而，这些通常驱动下游基因的弱表达。另一方面，强细胞特异性启动子对于rAAVs来说太长了，只能打包小于5 kb的序列(Hirsch et al.， 2016;Hudry and Vandenberghe, 2019)。那么如何在特定的神经元细胞类型中实现强视蛋白表达呢?这就是FLEx进入场景的地方。

FLEx:当夜晚与你有关时的一盏灯!

的FLEx(用于触发切除)开关(又名戴奥(Double-floxed我nverseO或DO (Double-floxedO定向是一个强大的工具，提供精确的时间和空间控制基因表达在活的有机体内(Schnütgen等，2003)。这是通过位点特异性重组酶实现的，例如Cre或隔爆在确定的识别位点诱发DNA重组(即，液态氧P和FRT(Abremski和Hoess, 1984;凡·达因2001;克里斯滕森·维克和克鲁克-马格努森，2018)。

光遗传FLEx载体在视蛋白基因(如通道视紫红质2,ChR2)上游包含一个强启动子，与报告基因(如mCherry)融合，从而容易检测到表达视蛋白的细胞。由此产生的融合基因被插入到相对于启动子的反义方向以防止其表达，并被两组不相容的识别位点(例如，液态氧P和液态氧方向相反。由于Cre不引起不匹配的识别位点之间的重组，它的存在首先诱导视蛋白反转，然后液态氧位点切除，因此锁定视蛋白进入正确的转录方向(图2)(Sharma和Zhu, 2014)。

FLEx是如何在特定神经元细胞中实现强视蛋白表达的?这可以通过使用Cre依赖病毒来实现，例如光遗传FLEx载体与转基因动物或在特定细胞型启动子下表达Cre的raav相结合。一旦被注射进大脑，病毒就会用不活跃的视蛋白基因感染所有的细胞;然而，在Cre表达细胞中，Cre诱导双絮凝视蛋白结构的重组，从而使其仅在特定的神经元细胞中在强启动子下表达。因此，FLEx确保了空间准确性和强视蛋白表达，这两者在光遗传学研究生理和行为过程中都是必不可少的(Abdallah et al.， 2018;Deubner et al.， 2019)。

例如，Taylor和他的同事使用基于rAAV flex的载体来研究睡眠和麻醉机制背后的神经回路。在Cre转基因小鼠中，他们瞄准了大脑腹侧被盖区(VTA)的多巴胺(DA)神经元。特别是，他们发现，DA神经元的光遗传刺激会在之前处于稳态全身麻醉的小鼠身上产生行为和脑电图证据(Taylor et al.， 2016)。

这些同样的神经元在动机行为中也发挥着核心作用(Juarez and Han, 2016)。然而，就在不久前，我们还完全不清楚DA神经元的哪个亚群能够激活食欲而不是厌恶刺激。在最近的一篇论文中，de Jong和同事使用基于rAAV flex的载体来回答这个问题，绘制并表征了VTA的DA神经元的活动。使用在活的有机体内在光遗传刺激下，他们同时记录了这个大脑区域离散亚群的电脉冲，证明了分离神经元输入以诱导厌恶或奖赏相关行为是可能的。FLEx向量的时空精度高和可逆的调制结合使用几种Cre转基因老鼠瞄准大脑不同区域启用详细的图纸和功能性神经电路架构的地形与动机相关的大脑区域的行为(德容et al ., 2019)。因此，FLEx载体代表了光遗传学理解大脑的细胞和分子机制的理想伙伴在活的有机体内．

---

非常感谢来自吉诺威的嘉宾博主Alessia Armezzani。

Alessia Armezzani在格拉斯哥大学获得病毒学博士学位。然后她搬到法国，在École Normale Supérieure de Lyon担任发育生物学博士后研究员。她对教育科学的热爱使她走上了教学的道路，现在她是一名非常快乐的科学传播经理genOway．

确认:
通过与吉诺威的合作，我们能够分销含有FLEx技术的材料。读了genOway新闻稿为更多的信息。

参考文献

Abdallah, Khaled等人。腺相关病毒2/9在小鼠初级传入物中传递Cre重组酶科学报告8.1(2018): 7321。PubMedPMID: 29743652．公共医学中心PMCID: PMC5943452．

艾布伦斯基，肯和罗纳德·霍斯。“噬菌体P1位点特异性重组。Cre重组酶蛋白的纯化和性质。生物化学杂志259.3(1984): 1509 - 1514。PubMedPMID: 6319400．

Atasoy, Deniz等。FLEX开关将channel rhodopin -2定位到多种细胞类型，用于成像和远程电路绘制。”神经科学杂志》上28.28(2008): 7025 - 7030。PubMedPMID: 18614669．

Belzung, Catherine, Marc Turiault和Guy Griebel。“研究恐惧和抑郁行为回路的光遗传学:批判性分析。”药理学、生物化学和行为学122(2014): 144 - 157。PubMedPMID: 24727401.

雅各布·G·伯恩斯坦和爱德华·s·博伊登。"用来分析行为神经回路的光遗传学工具"认知科学的趋势15.12(2011): 592 - 600。PubMedPMID: 22055387．公共医学中心PMCID: PMC3225502．

王志强，等。“毫秒级的，基因定向的神经活动光学控制。”自然神经科学8.9(2005): 1263。PubMedPMID: 16116447．

等。“中脑边缘多巴胺系统中编码厌恶刺激的神经回路机制。”神经元101.1(2019): 133 - 151。PubMedPMID: 30503173．公共医学中心PMCID: PMC6317997．

卡尔等。"下一代光学技术用于照明基因定位的大脑电路"(2006): 10380 - 10386。PubMedPMID: 17035522．公共医学中心PMCID: PMC2820367．

戴瑟罗斯,卡尔。“光遗传学”。自然方法8.1 (2011): 26．PubMedPMID: 21191368．

杜布纳，简，菲利普·库伦和伊尔卡·迪斯特。“研究哺乳动物大脑的光遗传学方法。”结构生物学的最新观点57(2019): 157 - 163。PubMedPMID: 31082625．

刘志强，等。微生物和动物视紫红质:结构、功能和分子机制。化学评论114.1(2013): 126 - 163。PubMedPMID: 24364740．公共医学中心PMCID: PMC3979449．

芬诺，利夫，奥弗·伊扎尔和卡尔·戴瑟罗斯。“光遗传学的发展和应用。”神经科学年刊34(2011)。PubMedPMID: 21692661．公共医学中心PMCID: PMC6699620．

等。在单细胞真核衣藻中，紫红质是具有趋光性功能的光感受器。自然311.5988(1984): 756。PubMedPMID: 6493336．

哈兹，哈特曼，还有彼得·海格曼。《衣藻中视紫红质调节的钙电流》自然351.6326(1991): 489。

赫希，马修L.，索尼娅J.沃尔夫和R. J.萨姆斯基。“传递超出AAV载体承载能力的转基因DNA。”神经系统疾病的基因治疗。哈门纳出版社，纽约，纽约，2016。21-39。PubMedPMID: 26611576．公共医学中心PMCID: PMC4971574．

胡珀，安德鲁和杰米·马奎尔。表达促肾上腺皮质激素释放激素的海马中间神经元的新亚型特征。海马体26.1(2016): 41-53。PubMedPMID: 26135556．

Hudry, Eloise，和Luk H. Vandenberghe。《神经系统治疗性AAV基因转移:临床现实》神经元101.5(2019): 839 - 862。PubMedPMID: 30844402．

华雷斯，芭芭拉和韩明虎。"接触药物后多巴胺能神经回路的多样性"神经精神药理学41.10(2016): 2424。PubMedPMID: 26934955．公共医学中心PMCID: PMC4987841．

罗迪什，哈维等人。分子细胞生物学．纽约:W. H. Freeman, 2000。书架ID: NBK21668。

松野八木，明美，向畑康夫。“细菌视紫质有两种可能的作用;不同色素沉着的盐杆菌菌株的比较研究。”生物化学与生物物理研究通讯78.1(1977): 237 - 243。PubMedPMID: 20882．

梅、袁、张峰。“光遗传学的分子工具和方法。”生物精神病学71.12(2012): 1033 - 1038。PubMedPMID: 22480664．

Oesterhelt, Dieter和Walther Stoeckenius。"来自盐杆菌紫色膜的类视紫红质蛋白"自然新生物233.39(1971): 149。PubMedPMID: 4940442．

Schnütgen, Frank等。“在小鼠细胞水平上监测cre介导的重组的定向策略。”自然生物技术21.5(2003): 562。PubMedPMID: 12665802．

年代沙玛，苏维娜和朱金芳。"条件基因修饰技术在小鼠中的免疫学应用"当前的免疫学协议105.1(2014): 10-34。PubMedPMID: 24700321．公共医学中心PMCID: PMC4100247．

等。“腹侧被盖区多巴胺神经元的光遗传激活可诱导全身麻醉后的复苏。”美国国家科学院院刊113.45(2016): 12826 - 12831。PubMedPMID: 27791160．公共医学中心PMCID: PMC5111696．

汤恩、克里斯和金伯利·r·汤普森。“光遗传学研究与临床应用综述”。目前的药理学协议75.1(2016): 11-19。PubMedPMID: 27960028．

格雷戈里·D·范·杜恩creo -loxp位点特异性重组的结构视图生物物理学与生物分子结构年度回顾30.1(2001): 87 - 104。PubMedPMID: 11340053．

维克，Zoé克里斯坦森，埃丝特克鲁克-马格努森。特异性、多功能性和持续发展:光遗传学在癫痫研究中的力量。细胞神经科学前沿12(2018)。PubMedPMID: 29962936．公共医学中心PMCID: PMC6010559．

魏格特，J.西蒙，等。“使神经元沉默:工具、应用和实验限制。”神经元95.3(2017): 504 - 529。PubMedPMID: 28772120．公共医学中心PMCID: PMC5830081．

张峰，等。"光基因工具的微生物视蛋白家族"细胞147.7(2011): 1446 - 1457。PubMedPMID: 22196724．公共医学中心PMCID: PMC4166436．

参考资料在Addgene博客188博金宝官网

• 了解更多关于FLEx向量
• 下载我们的质粒101电子书
• 阅读我们的质粒的博客文章

Addgene网站上的资源

• 访问我们的分子生物学参考
• 找到Addgene的creo -lox质粒
• 浏览质粒在Addgene