细胞凋亡或“程序性细胞死亡”在包括发育、免疫系统和细胞周转在内的一系列生物过程中起着关键作用。细胞凋亡是一个高度受控的过程，由发育线索和DNA损伤等内外部信号触发。这些信号激活了caspases的级联反应，caspases是一种蛋白酶，能够切割蛋白质。刽子手caspases在级联中最后被激活，并负责600多种细胞成分的降解，最终导致细胞碎裂和死亡(爱尔摩,2007）．
研究细胞凋亡在活的有机体内，科学家已经使用基因编码的荧光刽子手caspase记者。目前已有多种细胞凋亡报告，如共振能量转移(FRET)caspase记者。在这些报告中，FRET对由caspase裂解位点连接。用半胱天冬酶切断连接会导致荧光发射的变化。然而，FRET和基于荧光的记者有几个局限性。首先，由于蛋白质水解后供体和受体的荧光变化很小，FRET信号往往难以检测和量化．其次，由于组织自身荧光、细胞异质性和/或细胞位置变化等问题，生物体的荧光成像具有挑战性(等人，2016年，Zhang et al.， 2019）．从而有效地研究细胞凋亡在活的有机体内科学家需要一种动态范围大、亮度高的蛋白酶报告器。
的蜀实验室从加州大学旧金山分校设计了一种改进的细胞凋亡报告器，ZipGFP，利用自组装分裂的GFP (GFP1-10和GFP11)在蛋白酶活性后荧光增强10倍(等人，2016年）．然而，实验室希望通过增加荧光范围来更好地研究活体动物细胞凋亡的时空动态。为此，他们通过翻转GFP的单个β链，修饰了一种不同的自组装分裂GFP (GFP1-9和GFP10-11)，因此命名为FlipGFP。FlipGFP的荧光强度是其他报告的100倍(Zhang et al.， 2019）．
FlipGFP是如何工作的?
GFP包含11条β链和一个中心ɑ-helix，可以分为3部分:(1)β链1-9 (β1-9)和ɑ-helix， (2) β链10 (β10)和(3)β链11 (β11)。每个部分都含有荧光必需的成分和残基。当这些部分彼此分离时，蛋白质就不能发出荧光。当β10和β11连接在一起，但与β1-9分离时，它们会迅速与附近的β1-9链重组，在几十分钟内产生荧光(Cabantous et al.， 2013）．
舒实验室利用了这一点，提出了一个系统，其中荧光依赖于蛋白酶激活。正常情况下，β10-11是反平行的。为了防止结合，FlipGFP中的β链被重新设计，使它们彼此平行，因此不能再与β1-9相匹配。他们用两个二聚体(E5和K5)连接β10-11，使其形成平行构象。β11和其中一个连接子之间是一个一致的caspase-3(刽子手caspase)切割位点(DEVD)。序列裂解后，β10和β11重新排列到正常的反平行位置并发出荧光。
FlipCherry:红色荧光蛋白酶报告
为了添加荧光报告工具，Shu实验室还设计了一个基于超级文件夹Cherry (sfCherry)的红色荧光蛋白酶报告工具。像FlipGFP一样，sfCherry被分裂成β1-9和β10-11， β10-11被连接到TEV蛋白酶切割位点的E5和K5连接子强迫形成平行构象。TEV蛋白酶是一种高度特异性的蛋白酶，常用于蛋白质的切割。然而，基于sfCherry的蛋白酶报告最初在HEK293细胞中没有荧光。为了纠正这一点，Shu实验室首先通过定向进化将sfCherry的自组装能力提高了约20倍。然后，他们优化了两个链接器的长度，以生成一个会发出荧光的报告器:FlipCherry。FlipCherry提供了一个概念证明，即FlipGFP中使用的设计可以应用于其他荧光蛋白，以创建一组多色报告器，将能够一次成像多个蛋白酶(Zhang et al.， 2019)。金宝搏app下载
研究细胞凋亡在活的有机体内使用基于flipgfp的caspase报告基因
舒实验室成功地使用FlipGFP研究了HeLa细胞、斑马鱼胚胎的凋亡果蝇．他们用staurosporine(通过激活caspase-3诱导凋亡)处理表达FlipGFP的HeLa细胞，并在2 - 5小时内检测到荧光，时间与之前的方法一致。在斑马鱼中，Shu实验室使用FlipGFP跟踪胚胎发育过程中细胞凋亡的时空动态。GFP荧光随时间增加，在发育中的前脑和视网膜中显示出清晰的模式。这种模式与TUNEL染色一致，TUNEL染色是观察凋亡细胞的常用方法。最后，Shu实验室证明，基于flipgfp的caspase报告基因可用于可视化中肠肠细胞凋亡果蝇,到目前为止，这一观察一直很困难(Zhang et al.， 2019)。
结论
FlipGFP是一种动态范围大、亮度高的新型荧光报告器件。该报告在被刽子手caspases切割后，荧光增加了大约100倍。细胞死亡失败或细胞在错误的时间和/或地点死亡可能导致一系列疾病和病理，如神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症(Elmore, 2007)。这篇报道将让科学家们同时观察细胞凋亡的时空动态在体外以及在生物体内更好地研究和理解这些疾病和失调。
你可以找到质粒为FlipGFP和FlipCherry在Addgene。
参考文献
Cabantous, Stéphanie，等。“一种新的基于三重分裂- gfp关联的蛋白-蛋白相互作用传感器。”科学报告3(2013): 2854。PubMedPMID:24092409．公共医学中心PMCID:PMC3790201．
爱尔摩,苏珊。《细胞凋亡:程序性细胞死亡的回顾》毒物学的病理35.4(2007): 495 - 516。PubMedPMID:17562483．公共医学中心PMCID:PMC2117903．
杜子梁等。“基于gfp的荧光性caspase报告基因在体内成像凋亡的合理设计。”细胞化学生物学23.7(2016):875-882。PubMedPMID:27447051．公共医学中心PMCID:PMC5026494．
张强，等。“通过翻转GFP的β链来设计一种绿色荧光原性蛋白酶报告基因，用于动物细胞凋亡的成像。”美国化学学会杂志(2019)。PubMedPMID:30821975．
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