流式细胞术分析单细胞

你曾经想过在单个细胞中测量你感兴趣的蛋白质的表达吗?或者，您可能需要分析复杂群体中的特定细胞子集。你是否曾在生物安全柜里与克隆环共处数小时或遵循劳动密集型限制稀释协议?如果这听起来像你，那么流式细胞术可以帮助你克服这些挑战，使这些类型的实验更容易和更快地执行。

流式细胞术简介

流式细胞仪允许用户分析人群中的单细胞。单个细胞通过激光的路径并用各种可见光光源询问，允许用户评估细胞的尺寸，粒度和靶蛋白质组合物。它用于各种应用，例如测量靶蛋白表达水平，评估翻译后修饰，确定细胞健康，分析细胞周期阶段，以及检测复杂组织或样品中细胞的特定群体（1.）.当与细胞分选器结合时，该技术可用于分离细胞群中的特定细胞子集，称为荧光激活细胞分选或FACS (2.)通过分析单个细胞而不是整个细胞群，科学家们在观察中获得了统计能力。然而，尽管流式细胞术提供细胞水平的分析，但它不能用于亚细胞分析，如形态学或亚细胞定位研究。对于这些，必须使用荧光显微镜等替代方法。要了解更多关于最适合你的研究的荧光显微镜技术，请参阅Addgene的博客文章哪种荧光显微镜技术最适合我？

仪器仪表概述

流式细胞仪结合了三个系统从混合物中分析单个细胞(3.):

• 光学系统
• 射流系统
• 一个电子系统

细胞首先在一种称为鞘液的加压缓冲液中再悬浮，然后通过管子或毛细血管输送到激光器。当细胞在流体系统中移动时，它们通过一个流动细胞，该流动细胞限制流的大小，并迫使细胞在称为流体动力聚焦的过程中排成一列。这允许每个单元以单个文件的形式通过激光路径，并在其中由光学系统进行查询（图1）。

流式细胞仪检测到什么

单元大小和复杂度，使用可见光散射测量

光学系统有可见光和荧光光源。可见光通过时照亮每个细胞，并向不同方向散射。散射的程度被探测器捕获，并提供有关细胞的有用信息。继续沿同一方向前进的光被称为前向散射(FSC)，它提供了有关细胞相对大小的信息;细胞越大，产生的FSC越多。光线沿着最初的路径向侧面散射被称为侧面散射(SSC)，它提供了有关细胞复杂性的信息。一个具有高度内部复杂性的细胞，如广泛的膜，产生更大的SSC。

蛋白质表达，使用荧光蛋白融合测量

除了可见光，流式细胞仪还可以有多种荧光光源。当用荧光光源询问时，表达相关荧光团的细胞或用相关荧光色素染色的细胞会发出被探测器捕获的荧光信号。

发射光子的强度因细胞而异，具体取决于荧光水平。表达高水平荧光团或荧光色素染色蛋白质的细胞将比表达低水平蛋白质的细胞发射更强的光子。电气系统将荧光强度转换为电压脉冲，称为事件，并根据强度将每个事件分配给通道编号。较高强度的事件分配给较高的通道。在典型的分析中，用户将比较事件的转移强度。由于强度与表达呈正相关，细胞从阴性对照组转移越远，表达水平越高。

常规的流式细胞术实验使用2或3种不同的荧光颜色分别测量不同的目标。然而，流式细胞仪是高度通用的，有些可以容纳多达30种不同的颜色。这使得流式细胞术尤其适用于观察各种不同靶标的复杂实验。如果你计划在实验中使用荧光蛋白，但不确定选择哪种，请查看A金宝搏app下载ddgene的文章:我应该使用哪种荧光蛋白？

然而，融合蛋白会在蛋白质的N-或c -末端用荧光报告标记你感兴趣的蛋白质。融合蛋白的一个缺点是，标签会改变蛋白质的结构。在某些情况下，这会导致蛋白质功能的改变或完全丧失。此外，表达式的级别和时间也会受到标签的影响。

使用抗体共轭荧光团测量蛋白质表达

荧光抗体通过结合荧光蛋白的天然状态来绕过荧光蛋白融合的挑战。基于抗体的流式细胞术可以采用直接染色和间接染色两种方法。在直接染色中，针对靶点的一抗被偶联到荧光色素上。在间接染色中，一抗与靶点结合，荧光标记二抗与一抗结合。直接染色比间接染色快，并消除可能产生的非特异性染色使用二抗。它对细胞内染色也特别有用，因为大免疫复合物的结合可能受到阻碍。当表达水平较低时，间接染色是有益的，因为多个二抗可以与一抗结合，从而放大信号。

通过固定和渗透膜测量的细胞内蛋白质靶标

对于胞内蛋白靶，使用者必须先将蛋白质固定在细胞内，然后透过细胞膜使抗体通过细胞膜。甲醛固定在赖氨酸残基之间产生交联，从而保持蛋白质结构和表位的完整。然而，它不渗透细胞，并要求随后的渗透与洗涤剂如triton-x，皂素，或吐温。使用triton-x和tween等强力清洁剂时要小心，因为长期使用会溶解细胞。酒精，如乙醇或甲醇，通过变性蛋白质和溶解脂质(包括细胞膜脂质)一步就能固定和渗透。在某些情况下，这可能会掩盖抗原决定基，使免疫复合物不再识别它们。有时，使用者会结合方法，先用甲醛固定，然后再用酒精渗透。用户在计划固定时也应该记住他们的目标。如果同时对细胞表面蛋白和细胞内蛋白进行染色，则先对表面蛋白进行染色，固定并渗透，再对细胞内靶点进行染色。当使用这种方法时，避免固定敏感的荧光色素，如藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白。 If assaying a secreted protein, first block the Golgi apparatus with Brefeldin A to inhibit secretion and then follow the typical intracellular staining protocol.

用FACS分选细胞

除了流体、光学和电子系统外，FACS仪器还有专门的组件，可以转移细胞子集。在FACS过程中，样品流振荡产生液滴，当它们通过金属偏转板时带电。每个液滴包含一个单独的细胞，可以根据所需的参数进行评估。在管或平板中收集含有所要求参数的正胞的液滴，而含有负胞的液滴则丢弃。流式细胞仪可进行无菌操作，允许用户在收集后培养细胞。许多FACS分选机与96孔板兼容，作为收集容器，可以将单个细胞分类到每个孔中，便于用户分离并随后扩大单克隆培养。

解读流式细胞术数据

为了解释流式细胞术数据，用户通常首先创建FSC与SSC的点图，以便观察不同的细胞群并排除死亡细胞和碎片。例如，全血样本将包含包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞在内的混合细胞。由于大小和复杂性的差异，在FSC与SSC图上，这些细胞类型将分成不同的群体（图2）。

然后，用户可以围绕他们感兴趣的特定人群进行“筛选”，并进一步分析该细胞子集。例如，免疫学家可能对淋巴细胞和该群体的“门”感兴趣，以便进一步分析。由于不同的免疫细胞群体表达独特的分化细胞表面标记簇(CD)，这些标记可以在流式细胞术实验中被特定的荧光抗体靶向，并将作为一个独特的群体出现。在初始给淋巴细胞门控后，可以创建CD3 (T细胞标记物)和CD19 (B细胞标记物)的点图，将B细胞和T细胞分离成不同的种群(图2)。可能会对B细胞群进行门控，并创建一个包含cd19的细胞与总细胞数的直方图，以确定该样本中B细胞的数量。或者，他们可以创建各种CD标记的额外点图，进一步将B细胞群分离为祖B细胞、未成熟B细胞、浆细胞或其他细胞。

图2：由于其大小和复杂性的差异，来自整个血液样本的细胞将分离成正向散射（FSC）与侧散射（SSC）的曲线图中的单核细胞，淋巴细胞和粒细胞的不同群体。用户可以围绕其所需的细胞群门进行进一步分析。在该实施例中，通过绘制CD3与CD19分离B细胞，T细胞和天然杀伤剂（NK）细胞进一步选择淋巴细胞群和分析。

流式细胞术成功秘诀

分解细胞团块

流式细胞术实验中的成功取决于各种因素，包括样品制备，染色程序和对照。为防止仪器堵塞，请确保样品是单细胞悬浮液。对于倾向于聚集的细胞，通过样品通过尼龙网胞胎过滤器在仪器上运行之前分解丛。为了维持细胞健康和限制碎片，始终在冰上保持样本，并使用温和的液体而不是涡旋。

包括适当的控制

为了确保准确的数据分析，包括一套完整的控制。理想情况下，每一个流式细胞术实验都有一个不表达靶标的阴性对照和一个表达靶标的阳性对照。阴性对照对于确定非特异性染色的背景水平至关重要。

如果您使用用于检测的抗体，请包括通过通过染色程序的细胞进行未染色的控制减去抗体。未染色的控件允许您从目标单元格类型中检测到任何自发荧光，或者从固定中出现。还包括同种型对照，一种不与任何靶标结合但在相同IG亚类的同一宿主物种中升高的抗体，并与与您的主要抗体相同的荧光染料缀合。同种型控制允许您确定与初生抗体相关的非特异性染色水平。当按照间接染色方案时，还应包括次级抗体控制，其中从染色方案中省略了初生抗体。该控制允许您检测来自二抗引起的背景染色。

还建议用户包括可行性控制，因为这将允许您从分析中省略死亡或染色细胞;死亡或染色细胞往往具有更多的自发荧光和非特异性染色，导致误报。许多染料可用于可生存性对照，例如DNA结合染料和胺反应性染料。DNA结合染料，例如碘化丙锭，只能进入具有破坏膜的细胞，因为具有死亡或染色细胞的情况。DNA结合染料与需要固定和透化的方案不相容，因为这些方法需要损害细胞膜并且将导致所有细胞染色阳性。如果需要固定和透氧，如在细胞内染色中，考虑使用胺反应性染料，例如活/死染料。与DNA结合染料一样，胺反应性染料只能通过死细胞的膜。一旦在细胞中，胺反应性染料与在细胞质中的游离胺相互作用，导致死细胞荧光。

在进行多色流式细胞术实验时，用户还必须准备一组对照组，以帮助进行补偿。补偿是校正荧光染料之间发生的光谱重叠的过程。例如，FITC染料发射绿色、黄色和橙色光子，而PE发射黄色和橙色光子。如果在实验中同时使用FITC和PE，您需要一种方法来确定FITC和PE中黄色和橙色的相对贡献。在补偿过程中，特定荧光色素产生的信号从除专用探测器外的所有其他探测器上移除。为了确保适当的补偿，您必须在实验中为每种荧光色素添加单一染色样品。单一染色样品必须与任何实验样品一样明亮或更亮。此外，还应包括一组“荧光减一”对照组，实验中除一个样品外，所有荧光染色的样品。荧光减一面板将帮助您在数据分析期间设置选通。

我们希望本博客提供了用于单细胞分析的流式细胞术的概述以及用于设置基于抗体的流式细胞术实验的一些有用的背景信息。

引用和资源

引用:

Bonner WA, Hulett HR, Sweet RG, Herzenberg LA(1972)荧光激活细胞分选。科学仪器评论43:404-409。https://doi.org/10.1063/1.1685647

mcmckinnon KM(2018)流式细胞术综述。当前的免疫学协议120:。https://doi.org/10.1002/cpim.40.

Picot J, Guerin CL, Le Van Kim C, Boulanger CM(2012)流式细胞术:回顾，基础和最新仪器。Cytotechnology 64:109 - 130。https://doi.org/10.1007/s10616-011-9415-0

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