荧光CRISPR报告者：SRIRACCHA和GEmCherry2

如果你使用CRISPR进行基因组编辑，你怎么知道你的CRISPR实验在你的有机体或细胞类型中是否成功?您可以使用DNA测序或其他分子克隆技术，以确定CRISPR/sgRNA的实验效率，并确认对基因组进行了正确的编辑，没有任何脱靶效应。然而，这些方法可能是劳动密集型和相当耗时的。

由于Cas9/gRNA活性对于成功的CRISPR编辑实验至关重要，因此科学界确实需要高效的实时Cas9活性分析。最近，科学家们已经建立了CRISPR荧光报告分析，以量化靶向Cas9切割，并通过同源性定向修复（HDR）和非同源末端连接(NHEJ)。在这些记者中，编辑通常会导致荧光读数的变化。

在本博客中，我们将重点介绍两种荧光CRISPR报告方法，SRIRACCHA和GEMCherry2。我们将介绍单碱基对编辑CRISPR记者在不久的将来。

SRIRACCHA(稳定的，可逆的，用于分析CRISPR/ cas刺激的HDR活性的综合报告基因)

麦迪逊实验室创造了SRIRACCHA2017年至丰富和鉴定所需的CRISPR突变体(文等人，2018)。SRIRACCHA使用转座因子转座子将包含嘌呤霉素抗性基因的报告基因稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中，该报告基因包含目标位点(与你想在基因组中突变的序列相同)和框架外的H2B(组蛋白)-GFP报告基因。

图1:SRIRACCHA reporter构造。来自温等人，2017.

将报告程序引入单元格后，就可以进行编辑了。然后用几种不同的结构对这些细胞进行转染，使报告细胞工作并进行所需的基因组编辑:

• 一种供体质粒，包含与框架内H2B-GFP连接的嘌呤霉素抗性基因。这种视觉读出允许通过简单地改变转染细胞时使用的gRNA，轻松筛选不同的gRNA。
• 含有Cas9的质粒。麦迪逊实验室还创建了一个可诱导的SRIRACCHA系统（isrraccha），其中Cas9表达通过4-OH-T和强力霉素激活。
• 一种以所需基因为目标的gRNA(其序列也在报告基因中发现)。
• 对照RFP表达质粒。

通过这种设置，所有成功转染的细胞都将表达RFP，而含有报告基因的细胞将表达GFP，该报告基因被Cas9切割并使用提供的供体质粒通过HDR修复。如果有GFP表达，推测内源性靶点也会被NHEJ切割和修复。RFP与GFP表达细胞的比率可实时读出Cas9活性。

通过使用RFP:GFP比率，可以将已编辑的单元格与未编辑的单元格进行排序。在一项针对该基因的实验中NFE2L2，麦迪逊实验室发现，与未排序细胞相比，H2B-GFP表达细胞内源性indel编辑数量增加了2-4倍(Wen et al.， 2018)。因此，SRIRACCHA使科学家能够量化Cas9活性和sgRNA效率，并通过荧光报告的存在对突变体进行富集。最后，一旦一个突变体被识别出来，PB转座酶可以轻松无缝地移除整合的GFP报告，只留下你想要的基因组编辑。

在Addgene找到SRIRACCHA质粒

用于评估CRISPR/Cas9活性的改进单体荧光蛋白GEMCherry2

引导RNA结构和你试图瞄准的基因组中的位置在其中起着重要作用Cas9活性与效率（Sander和Joung，2014年）。因此，确定最佳sgRNA以确保CRISPR实验的成功至关重要。但是怎么做呢？有几个系统可以做到这一点，但大多数都是劳动密集型的，需要多种荧光蛋白，而且效率不高。为了克服这些问题金宝搏app下载德纳姆实验室发展出修饰单体红色荧光蛋白（RFP），命名为宝石2，可以快速有效地评估Cas9切割部位和活动(Knudsen等人，2018)。

为了创建GEmCherry2，Denham实验室首先将框架外CRISPR基因组靶区整合到mCherry的N末端。为了防止替代起始位点启动，实验室移除了天然蛋氨酸起始位点。由于“插入mCherry的基因组片段”，第一次迭代被命名为GEmCherry1。然而，这一突变的蛋氨酸不足以阻止选择性启动，因此他们在位置14和21处突变蛋氨酸以产生GEmCherry2。Denham实验室进行了其他一些小改动，创建了另外两个版本，但在背景荧光和帧内荧光方面没有超过GEmCherry2。

图2：GEmCherry reporter。来自Højland Knudsen等人，2018年.

那么，GEmCherry2是如何工作的呢?前提是插入到mCherry n端基因组区域可以被sgRNA引导的Cas9靶向，导致DSB断裂。这种双边带由NHEJ修理这取决于插入或删除的核苷酸，可以导致mCherry的帧内位移，从而表达。作为概念的证明，德纳姆实验室比较了在三个不同的基因组位点的编辑AAVS1使用GEmCherry2轨迹。在这个实验中，他们通过FACs排序发现了mCherry表达的明显差异，再次证实了sgRNA结构和基因组识别位点在CRISPR-Cas9效率中发挥了很大作用。他们继续使用GEmCherry2来识别最有效的sgrna，以定位一个特定的位点，从而在人类胚胎干细胞中创建敲除。

在Addgene找到GEmCherry2报告质粒

总体上SRIRACHA和GEmCherry2报告系统提供了高效、快速和实时的Cas9/gRNA读出效率。因此，如果你正在寻找最有效的gRNA，并为你感兴趣的CRISPR突变体丰富细胞，请尝试这些方法。

参考文献

• Højland Knudsen C， Ásgrímsdóttir ES, Rahimi K, Gill KP, Frandsen S, Hvolbøl Buchholdt S, Chen M, Kjems J, Febbraro F, Denham M(2018)一份用于评估CRISPR活性的修饰单体红色荧光蛋白报告。细胞与发育生物学前沿6。https://doi.org/10.3389/fcell.2018.00054

• Sander JD，Joung JK（2014）用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR Cas系统。自然生物技术32:347–355。https://doi.org/10.1038/nbt.2842

• 温Y，廖G，Pritchard T，赵T-T，Connelly JP，Pruett Miller SM，Blanc V，Davidson NO，Madison BB（2017）一个稳定但可逆的综合替代报告者，用于分析CRISPR/Cas9刺激的同源定向修复。生物化学杂志292:6148–6162。https://doi.org/10.1074/jbc.m117.777722

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