超过腺相关病毒大小限制的转基因的四种包装方法

缺点:

• 通常，与使用单个超大尺寸载体相比，重叠分裂载体具有相同或更高的转基因表达，但并不总是如此。
• 血清型和组织/细胞型的结合可能对AAV重叠的转基因表达率有很大的影响，因为这两个变量都会影响细胞是否会与这两个载体的多个拷贝共转导。

使用的例子:

• 哈尔伯特等人，2002年使用重叠量为440或1000bp的重叠载体递送碱性磷酸酶基因对小鼠气道上皮细胞的影响。该载体可转导约10%的细胞，转导率与单个AAV相似。
• 奥多姆等，2011年使用一个有372 bp重叠的重叠载体将微型营养不良蛋白基因传递到肌肉营养不良的小鼠模型中。在正常肌肉中，mini-dystrophin的表达水平低于野生型dystrophin的表达水平，而重叠分裂载体处理小鼠的肌肉生理性能有改善。

2.Trans-splicing

概述:对于trans-plicing，剪切位点供体和受体序列被用来重建转基因的两个片段。转基因的AAV编码部分A包含一个启动子和转基因的5 ' -片段，然后是剪接位点供体。转基因的AAV编码部分B包含一个剪接位点受体，后面是转基因的3 '端。当一个细胞被两种病毒转导时，如果编码转基因a部分和B部分的AAV基因组形成一个异二聚体，那么转基因的两个半部分的前mrna的剪接将重建全长转基因。

缺点:

• 跨接发生在ITR连接处，这可能是一个速率限制步骤，但是外显子分裂位点序列的优化可以提高跨接率(Lai et al.， 2005)。
• 跨接并不总是表现出色单一的装甲防护(Hirsch et al, 2013)。

使用的例子:

• Lai等人，2005年使用反式剪接载体将一个6 KB的迷你营养不良蛋白基因传递到肌肉营养不良的小鼠模型中。测试了三种不同的剪接位点供体和受体序列，用最优序列，组达到了~80%的肌细胞表达迷你肌萎缩蛋白。

3.混合动力

概述:该方法结合了重叠法和反剪接法。转基因AAV编码的A部分包含启动子、5′半转基因、剪接供体序列和同源区。AAV编码基因的B部分包含同源区，一个剪接受体序列，转基因的3 '半。全长基因通过重叠或反式剪接机制重组。

两个载体的剪接位点、供体和受体序列以及同源区域可以来自转基因的一个内源性内含子，也可以由非内源性序列组成，如a来自丝状噬菌体F1的77bp长高度重组同源序列(Trapani et al.， 2014)。

缺点:

• 的选择同源序列会影响转基因的表达水平，可能需要针对每个独特的应用进行优化(Trapani et al.， 2015)。
• 用杂交方法可以看到转基因小片段的表达。虽然这些片段可能没有功能，但它们可能是显性阴性和/或有毒的。一个潜在的解决方案是在转基因的5 '剪接供体的上游和3 '剪接受体的下游添加一个框架内降解序列，以帮助防止此类截断蛋白的积累。

使用的例子:

• Ghosh等人，2008年利用一个具有872 bp长的重组基因同源序列的杂交分裂载体将LacZ传递到小鼠肌肉中。通过β-半乳糖苷酶活性测定，杂交载体的表达量为单一载体的81%，但显著高于重叠(34%)或反式剪接(62%)载体的表达量。

4.序列同源定向修复

概述:序列同源重组方法使用两个序列提供大的供体模板与CRISPR/Cas9的同源定向修复(HDR)．供体A包含:与基因组中待整合位点400bp同源臂，转基因的“A部分”，介导供体模板整合的gRNA靶位点，使整合后的位点重组;以及gRNA靶位点后的填充DNA序列。

供体B包含:与供体A的400 bp同源臂，以及转基因的“B部分”。

这两个aav在一个步骤中共转导，并作为两个连续的crispr介导的HDR事件的供体，从而导致更大的供体模板的整合。

缺点:

• 转基因表达因这种方法而异在人原代T细胞和造血干细胞及祖细胞(HSPC)中~10%的表达，在K562细胞系中~40%的表达(Bak et al.， 2017)。
• 由于这种方法依赖于双链DNA断裂修复，如果非同源端连接(NHEJ)在第一个HDR事件之后破坏gRNA靶位点，那么第二个HDR事件就不能发生了。
• 最后，根据其设计，供体A可能能够表达一个截断的蛋白。这可以通过在gRNA靶位点下游的任何阅读框中排除供体a的终止密码子来避免，以便转录本进行不间断的衰变(Frischmeyer et al.， 2002)。

如何选择分割AAV的方法

由于转基因的重组有两种方法，混合双载体系统相对于重叠和反式剪接方法有一些优势，但目前还没有一种理想的分裂载体系统。总的来说，从分裂载体表达转基因的效率是不一致的。对基础知识有更深刻的理解AAV然而，生物学将有助于改进分裂载体策略，并导致更大、更一致的转基因表达。

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