CRISPR 101:核糖核蛋白(RNP)传递

CRISPR极大地提高了科学家改变基因组的能力，带来了基因组工程的革命，新技术正在迅速发展。进行CRISPR实验至少需要递送两种成分:Cas9蛋白和针对你感兴趣的基因组位点的引导RNA (gRNA)。这通常通过用质粒转染细胞来实现，例如PX459，它编码Cas9并包含一个用于插入自定义gRNA的站点。虽然这种方法已经被证明对科学家非常有价值，但在使用这种方法时，必须考虑一些潜在的复杂性:

1. 细胞必须经得起转染或病毒转导
2. Cas9和gRNA的表达必须选择合适的启动子
3. 质粒DNA可以并入基因组
4. Cas9表达延长可导致脱靶效应
5. 对Cas9转录和翻译的要求延迟了编辑

什么是Cas9-gRNA核糖核蛋白?

一种可选择的方法，可以避免许多这些复杂性，是直接交付核糖核蛋白(RNP)，由Cas9蛋白与靶向gRNA的复合物组成，对你感兴趣的细胞。与基于质粒的Cas9/gRNA表达相比，Cas9 RNPs能够以类似的效率切割基因组目标，可以用于目前CRISPR的大多数基因组工程应用，包括:生成单基因或多基因淘汰赛在多种细胞类型中，基因编辑使用同源定向修复(HDR)和生成大基因缺失．

Cas9 RNPs的优点是什么?

使用rnp进行CRISPR实验有很多优点。

• RNP方法常用于难以转染的细胞，如原代细胞。
• 使用RNPs还可以缓解在普通真核启动子(如许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子)不表达的细胞中出现的蛋白表达困难。
• 由于这种方法不需要外源DNA的传递，而且Cas9-gRNA RNP随着时间的推移会降解，使用RNP可能会限制脱靶效应的潜力。
• Cas9 RNPs在转染后不久就可检测到高水平，并通过蛋白质降解途径迅速从细胞中清除。
• 这使得Cas9 RNPs在需要有限表达Cas9且需要考虑特异性的CRISPR应用中很有用，例如敲除生成或同源重组。然而，需要Cas9长期表达的实验，如利用荧光团标记的dCas9可视化基因组位点可能需要使用质粒或病毒介导的传递。

你已经决定使用rnp了，现在怎么办?

Cas9-gRNA核糖核蛋白的制备

这种CRISPR实验的第一步是生成RNP复合体。虽然一种选择是从商业供应商那里购买Cas9蛋白和gRNA，但这通常是昂贵的。另一种方法是表达和纯化his标记的Cas9大肠杆菌使用质粒，例如pET-28b-Cas9-His从亚历克斯Schier的实验室．gRNAs可以在体外转录自ssDNA，它可以由商业供应商生成，如踊跃参与．然后这两个组件一起孵化形成RNP。概述这些步骤的详细协议已由两家机构公开雅各玉米和亚历克斯Schier实验室。

交付Cas9-gRNA核糖核蛋白

使用RNP进行CRISPR实验的一个优势是可以使用多种方法来传递Cas9-gRNA RNP。这一优势让科学家们得以大展身手在体外和在活的有机体内CRISPR在实验系统中的研究可能不适合基于质粒的方法。

RNP最常见的传递技术之一是电穿孔(上图中的A)，它在细胞膜上产生小孔，允许RNP进入细胞质。除了在细胞培养中使用这项技术，它还被应用于小鼠受精卵的基因组编辑，通过一个被称为CRISPR-EZ (脆RRNPElectroporation的Zygotes)（Chen et al. 2016)．对于涉及HDR的CRISPR实验，电穿孔技术可以与细胞类型特异性试剂结合，这种技术被称为核感染，在核膜上形成孔，允许DNA模板进入。

其他技术，如脂质介导的转染(上图中的B)，还处于早期发展阶段。大卫·刘的实验室演示了阳离子lipid-mediated方法将Cas9-gRNA rna递送到小鼠内耳毛细胞(Zuris等人，2015年)．最近描述了一种使用rnp的更有针对性的方法在体外，并希望最终使用这种方法在活的有机体内应用程序。该技术利用含有受体配体(C在上图)的Cas9蛋白，导致通过特定的细胞类型内化Cas9-gRNA rnp（Rouet et al. 2018)．这是使用Cas9突变体(Cas9M1C/C80S)完成的，该突变体含有两个表面暴露的半胱氨酸，包括天然的C547，允许与吡啶二硫激活配体连接。

由于对作物脱靶突变和转基因整合的担忧，将Cas9-gRNA rnp传递给植物，作为质粒基础技术的替代，一直是一个紧张的研究领域。实现这一目标的两种方法是聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转染和未成熟胚胎的生物轰击(梁等人，2017)．peg介导的方法，虽然在技术上不太困难，但往往效率低，而生物轰击，可以有很高的效率，需要专门的设备，如基因枪。根据实验的性质，研究人员要决定哪种方法对给定的实验最合适。

对rnp介导CRISPR实验的考虑

虽然在CRISPR实验中使用Cas9-gRNA RNPs可以减少许多潜在的并发症，但这些类型的实验还需要考虑其他因素。一个重要的考虑是Cas9-gRNA RNP会随着时间的推移被细胞降解。因此，RNP介导的CRISPR实验可能不适用于需要稳定Cas9表达的实验，例如将Cas9与荧光蛋白融合用于标记核酸靶点。而Cas9-gRNA rnp则显示出在活的有机体内研究表明，Cas9蛋白在宿主体内的免疫原性和稳定性知之甚少。事实上，研究已经表明Cas9蛋白质Geobacillus stearothermophilus在人血浆中更稳定比标准spCas9 (Harrington等人，2017年)．最后，与任何科学研究一样，技术的选择往往取决于研究人员对不同系统的熟悉程度。在您的实验中使用Cas9-gRNA rnp可能需要一些步骤，如蛋白质表达和纯化，这将需要额外的实验室试剂、设备和专业知识。

最终的想法

Cas9-gRNA RNP方法为科学家提供了一种额外的方法，可以将CRISPR成分传递到他们感兴趣的实验系统中。使用这种方法可以缓解使用质粒系统时可能出现的许多问题，最明显的是在难以转染或转导的细胞中进行CRISPR研究的能力。当使用Cas9-gRNA rnp时，可能需要在实验室中生产Cas9蛋白和gRNA，一旦获得这些蛋白和gRNA，就可以快速进行基因组编辑，在许多情况下，减少脱靶效应的机会。随着CRISPR领域的不断发展，rnp的使用很可能将在其持续发展中发挥重要作用。

Andrew Hempstead是Addgene的高级科学家。安德鲁的兴趣包括基因组工程和微生物学。

参考文献

1.陈，肖恩，等。利用CRISPR核糖核蛋白电穿孔技术对受精卵进行高效的小鼠基因组编辑生物化学杂志(2016): jbc-M116。PubMedPMID: 27151215．公共医学中心PMCID: PMC4938170．

2.John A.等。“阳离子脂质介导的蛋白质传递可以在体内和体外进行高效的蛋白质基因组编辑。”自然生物技术33.1(2015): 73。PubMedPMID: 25357182．公共医学中心PMCID: PMC4289409．

3.Rouet, Romain等。《受体介导的CRISPR-Cas9内切酶用于细胞类型特异性基因编辑》美国化学学会杂志140.21(2018): 6596 - 6603。PubMedPMID: 29668265．公共医学中心PMCID: PMC6002863．

4.梁震，等。“利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物对面包小麦进行高效的无dna基因组编辑。”自然通讯8(2017): 14261。PubMedPMID: 28098143．公共医学中心PMCID: PMC5253684．

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