本文更新于2020年8月20日。
什么基因在你的表现型中是重要的?许多科学家研究的疾病的潜在遗传原因尚不完全清楚。确定哪些基因对表型是重要的，可以导致大量额外的实验，以调查个别基因或整个途径在特定疾病过程中的作用。虽然CRISPR肯定不是进行所谓的“前向基因筛选实验”的第一种手段，但它肯定是最强大的。在这篇博文中，我们将讨论如何做到这一点CRISPR库正在被用于进行全基因组筛查，并突出一些通过Addgene公开提供的试剂。
是什么让CRISPR如此特别?
CRISPR/Cas9相对于以前的基因组编辑技术的一个主要优势是它的简单性和多功能性。CRISPR/Cas9由两部分组成:非特异性内切酶(Cas9)和单链引导RNA (gRNA)。gRNA内的~20核苷酸靶向序列由用户定义，它可以很容易地修改，以将Cas9靶向到几乎任何基因组位点，只要目标与基因组的其余部分相比是唯一的，并立即定位到原间隔邻近基序(PAM)序列。野生型Cas9和gRNA的共传递在靶DNA中产生双链断裂，当修复时容易出错非同源端接（NHEJ），通常导致目标基因内的功能缺失突变。CRISPR也可用于激活或压抑不永久改变基因组的靶基因。如果您想了解各种CRISPR技术，请查看Addgene的CRISPR指南．
哪些基于CRISPR的试剂可用于全基因组筛查？
全基因组筛选实验的目标是产生和筛选突变细胞群，以识别特定表型的相关基因。CRISPR由于具有广泛的潜在靶序列和易于生成含有gRNA的质粒，因此可以很容易地扩大用于全基因组筛查。CRISPR全基因组筛选实验常用慢病毒向表达Cas9的细胞输送聚集的gRNAs。汇集的慢病毒CRISPR文库（简称“CRISPR文库”）由含有慢病毒转移载体的gRNA的异质群体组成，每个载体靶向基因组内的特定基因（见图2）。设计了单独的GRNA在网上使用公开可用的gRNA设计软件然后将汇集的GRNA克隆到慢病毒转移载体中以创建CRISPR文库。
通过将gRNA文库与上述Cas9衍生物结合，CRISPR文库可以敲除、激活或抑制靶基因。有几个CRISPR库是公开的可通过Addgene获得，而且还在不断增加．请记住，库的好坏取决于您使用它们进行的实验！一个完善的生物学问题和实验系统对于确保您选择正确的CRISPR文库是绝对必要的。
选择适合你的CRISPR库
在为你的实验选择CRISPR库时，有几个因素需要考虑。
1.你的细胞来源于什么物种？目前，Addgene携带CRISPR文库，目标是老鼠、人类、苍蝇、，E．大肠杆菌，和弓形虫基因。
2） 你想做什么基因改造？Addgene携带用于基因敲除、激活、抑制和条形码的CRISPR文库。
3）你是在试图瞄准基因组中的每一个基因，还是一类特定的基因？Addgene目前携带多个全基因组CRISPR文库和一系列子文库针对特定种类的人类基因．
CRISPR筛选包含哪些步骤?
使用CRISPR文库进行正向遗传筛选是一个多步骤的过程(见图2)。在大多数情况下，CRISPR文库的浓度太低，无法用于实验。因此，第一步是扩大你的图书馆达到足以产生慢病毒的浓度。一定要使用下一代测序来检查扩增的质量. 如果你获得了即用慢病毒制剂从Addgene，您可以跳过以上步骤！
然后用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞，以产生异质的突变细胞群，每个细胞或一组细胞含有不同基因的突变。文库可以在1-质粒系统中获得，其中Cas9包含在含有gRNA的质粒上，或者在2-质粒系统中，Cas9必须单独递送。
突变细胞通过药物选择或基于荧光的细胞分选富集和筛选特定表型。例如，突变细胞可以用于药物筛选，以确定产生耐药性的基因。用感兴趣的药物处理突变细胞，并分析gRNA在耐药人群中的分布，与未处理的对照组进行比较。在这种情况下，“富集”的grna与突变时产生耐药性的基因相对应。这类实验的发现可以阐明细胞对药物产生耐药性的机制，并可以确定导致细胞不受控制生长的疾病(如癌症)的未来治疗靶点。
关于成功屏幕的注意事项和提示
下一代测序-CRISPR文库包含数千个gRNA质粒，仅通过每个质粒上的唯一条形码识别。因此，扩增和筛选后对CRISPR文库进行测序需要使用下一代测序．
表示-大多数文库每个目标基因包含3-6个gRNA，保持每个gRNA在群体中的分布是关键。由于特定GRNA的富集或耗尽而导致的代表性丧失可能会导致结果扭曲。
选择单元格类型-理论上，CRISPR屏幕可以使用任何类型的电池。然而，在你的突变种群中保持足够的代表性需要大量的细胞作为起始材料。因此，丰度低的细胞类型并不特别适合全基因组筛查。
避免假阳性和假阴性-与任何实验一样，使用适当的控制，多次复制和几种细胞类型可以加强你的结果。针对同一基因的多个GRNA的富集或缺失可以有力地证明特定基因对特定表型实际上是重要的。应该独立地验证屏幕上的每一次命中，以确保所需的修改产生您首先筛选的表型。
通过适当的实验设计和验证实践，CRISPR库可以帮助您了解更多有关您感兴趣的表型的信息。有关CRISPR屏幕的更多详细信息，请查看Addgene的2016年出版物“使用聚合慢病毒CRISPR文库的实际考虑(McDade等人，2016)。要了解一点关于CRISPR/Cas9如何用于其他类型的实验，请查看我们的CRISPR质粒和资源页面．
工具书类
McDade JR, Waxmonsky NC, Swanson LE, Fan M(2016)使用聚合慢病毒CRISPR文库的实际考虑。当前的分子生物学协议115:。https://doi.org/10.1002/cpmb.8
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