从慢病毒转导中获得最多

慢病毒是一种强大的实验室工具，经常被用来建立稳定表达感兴趣基因的细胞系。虽然使用慢病毒的一般方法，感染和选择，似乎简单，但在现实中，许多人发现使用慢病毒是耗时、困难和缺乏重现性。继续读下去，了解一些技巧，以最大限度地利用慢病毒转导实验。

爱你的细胞，它们也会爱你

成功的慢病毒感染始于你的细胞，包括包装细胞和目标细胞。组织培养不当会导致低浓度和穷人转导。细胞株应按常规进行传代培养，其密度应低到足以防止融合，但又高到足以促进细胞生长。过度生长的培养刺激细胞周期的静息阶段;静止细胞不吸收核酸或表达转基因，也不活跃分裂细胞，导致低慢病毒滴度。

另一个需要考虑的因素是文化解冻后的年代。一般来说，培养物的传代数越高，转染和转导效率越低。培养物只应传代20-30次，然后丢弃和解冻一个新鲜的小瓶。在许多实验室，由于缺乏文件和实验室人员的高流动率，细胞存储的历史可能有点可疑。如果你不确定你正在使用的线条的背景，最好从头开始。从信誉良好的分销商获得所需细胞系的小瓶，例如美国类型文化收藏并冷冻尽可能多的早期通道试管。

支原体污染是经常困扰实验室和阻碍实验的一个问题。支原体污染已证明来自多种来源，如血清、其他细胞系或受感染人员，并可持续存在而不被发现;与酵母菌、真菌或细菌等更大的微生物感染不同，支原体在浓度达到10时很难检测到8培养液混浊前每毫升细胞数。支原体与宿主细胞争夺营养，并可能发生改变表达式受体、离子通道和生长因子导致细胞系的变化增长和行为．支原体污染的迹象可能是微妙的，可能包括饱和密度降低，生长速度下降，或结块。为确保以组织培养为基础的实验得到最好的结果，实验室应定期检测支原体污染。有几个市售支原体检测试剂盒使用检测细胞系、ELISA、荧光测定法或基于pcr的方法来检测即使是低水平的污染。对于那些喜欢更经济的检测模式的实验室来说，'等。概述一个自己动手的基于pcr的方法，完全与自由可用的阳性对照。

常规检查你的细胞系是否有支原体，如果培养物过于融合或过于陈旧就将其丢弃。确保你和健康快乐的细胞一起工作是提高病毒产量和感染的最简单的方法之一。

伟大的转导始于伟大的病毒

如果拥有快乐细胞是成功感染慢病毒的第一步，那么快乐病毒就是第二步。在采集慢病毒时，一些实验室倾向于从多个时间点采集和集中，而另一些实验室则选择转染转移和包装质粒后的一次采集。多重收获策略的一个好处是，每天你都在为你的生产者细胞提供新鲜的培养基。每天交换培养基有助于缓解与pH变化相关的细胞压力，以及由于培养的高细胞密度所造成的资源消耗。除了有益于细胞，介质交换也可能影响你收获的慢病毒颗粒的质量。研究已经证明渗透压和pH值的极端变化可以使病毒包膜不稳定。多重收获方法的一个缺点是，它往往导致更低滴度的病毒的体积更高。在这种情况下，你可能需要考虑一下集中你的病毒准备．

储存也可以在慢病毒转导的成功中发挥作用。冻融循环对慢病毒稳定性的影响取决于多种因素，如转基因表达、使用的病毒储存缓冲液和其他实验参数。例如，虽然通常不建议冷冻解冻，光明战记et al。发现在pH值为6的环境下产生的慢病毒能够抵抗多次冻融循环。因此，除非绝对必要，最好避免冻融慢病毒制剂。许多实验室尝试将新收集的慢病毒用于下游应用。虽然这确保了使用最高滴度的病毒，但并不总是可行的，特别是当慢病毒库存需要滴定时。如果储存时间少于一天，慢病毒可以保持在4°C.对于长期储存，病毒制剂应分为一次性等价物，并在-80℃保存°C.一些报告表明，快速冷冻病毒在a干冰/乙醇在储存前，用液氮或水浴。

了解你的目标细胞

实验室倾向于遵循慢病毒感染的一般程序，产生病毒，滴度病毒滴定慢病毒准备)和感染。虽然这种方法是成功感染的一个很好的开始，但有一点需要考虑的是病毒是如何滴度的。大多数滴度方法都能转导到HEK293、H0或A549等高度允许的细胞系，并假设在这些细胞系中获得的结果可以翻译到其他细胞系。然而，不同细胞类型的生理差异可能使这一假设不正确。慢病毒转导的最早步骤之一是病毒包膜与靶细胞表面受体之间的相互作用。慢病毒可能的相互作用以及因此可能的目标是由包膜蛋白决定的。很多时候，慢病毒载体是用非本地的188完整比分直播包膜设计的，这个过程叫做pseudotyping．带有VSV-G包膜蛋白的伪型慢病毒使用低密度脂蛋白受体感染细胞并有广泛的宿主范围。然而,病毒准型而其他包膜蛋白的靶蛋白数量有限，因此在一种细胞类型中获得的效价可能不能很好地转化为其他细胞类型。为了克服这个问题，尝试用一系列稀释的慢病毒准备液进行转导。希望通过使用更浓缩的稀释液，你将能够克服受体表达的差异。

这一切都在其中

即使在慢病毒包膜蛋白附着到细胞表面受体之前，在感染过程中也发生了其他重要的结合事件。这些结合事件可被带负电荷的细胞与病毒的静电斥力破坏。为了避免这个问题，转导通常使用带正电的聚苯。有趣的是,一项研究发现替代的聚阳离子，如deae -葡聚糖，可以提高转导效率。此外，本研究发现，不仅不同厂家的血清，而且同一来源的不同批次血清之间的转导效率也存在差异。常规生产慢病毒的实验室可能要考虑测试各种阳离子和血清来源，以确保最好的可能的转导。

是一致的

一旦你的实验室为特定的应用建立了最好的条件，坚持下去!变化细胞密度、体积、孵育时间和MOI等变量都会影响慢病毒感染的成功。为了确保高质量和可复制的结果，始终正确地照顾您的细胞系和病毒，并在遵循协议时保持一致。

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