这篇文章由客座博客Joachim Goedart贡献，他是阿姆斯特丹大学分子细胞学和van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。
用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质以研究其功能是荧光蛋白最常用的应用之一。金宝搏app下载这些融合蛋白使观察活细胞和有机体中的蛋白质成为可能。嵌合体的两个组成部分都是由DNA编码的。由于研究人员可以以他们喜欢的方式生成几乎任何DNA序列，融合蛋白的设计和工程相对简单。然而，在保持感兴趣的蛋白质的所有天然特性的同时产生融合可能是具有挑战性的。在这篇博客中，我将讨论产生融合蛋白的策略，并强调其设计的某些方面。
蛋白质的大小和形状很重要
蛋白质的大小和形状很重要绿色荧光蛋白Aequorea victoria它的变体是基因编码的荧光探针。其中的一个限制是GFP的大小:~240个氨基酸或约28kda。GFP及其同系物具有-桶状结构。虽然β桶对其他蛋白质没有很强的亲和力，但由于其大小，仍可能阻碍标记蛋白的功能或活性。这种干涉称为空间位阻。例如，GFP可以阻断催化位点或阻断翻译后修饰所必需的结合位点或基序。尽管有这些潜在的问题，绿色荧光蛋白已经被成功地用于无数的融合蛋白。
选择单体蛋白，避免粘稠的情况
其次是尺寸，可能的均二聚和更高的阶荧光蛋白的低聚化金宝搏app下载是一个问题。荧光蛋白的低聚化倾向被称为“粘性”。金宝搏app下载由于荧光标签应作为惰性发光模块运行，应避免任何GFP同源二聚的倾向，因为它将使蛋白质的大小加倍。此外，它增加了亲和性，因为它使每个单位的结合位点数量翻倍。
有几种方法测量粘性．在体外超离心法或凝胶过滤法是最常用的分析方法。然而，这些可能不能反映细胞中的情况。因此，关键融合蛋白(如微管蛋白或连接蛋白)的定位被用作二聚体的代理(Shaner等人，2008年-补充图C)。然而，这些测定是定性的。组织光滑内质网(OSER)检测(Costantini等人，2012)根据OSER螺纹的外观，测量靶于质粒内网的FPs的均二聚化。这种方法是定量的，是目前评估细胞中寡聚化的标准。
除了测量粘性，一些研究人员还收集了荧光蛋白特性的数据，如亮度，耐光性、成熟时间和各种荧光蛋白的酸敏感性(金宝搏app下载Botman等人，2018年；Cranfill等，2016；兰伯特,2019)．这些特征很重要，但比粘性更重要。根据我的经验，在哺乳动物细胞中表现为金宝搏app下载单体的荧光蛋白包括:mTurquoise2、mEGFP、mNeonGreen、mScarlet(-I)和mCherry。
保持连接器序列简短
在绿色荧光蛋白应用的早期，许多人关注荧光蛋白的空间位阻。因此，科学家开始在感兴趣的蛋白质和荧光蛋白之间使用相对较长的连接。它们要么(i)由多个克隆位点编码，因此由随机氨基酸序列组成，要么(ii)设计成惰性的非结构化肽，因此由甘氨酸、丝氨酸和其他小型非脂肪氨基酸组成。然而，长连接子增加了融合蛋白被蛋白酶裂解的机会。
现在，有了足够的结构信息，可以清楚地看到荧光蛋白的c端来自于金宝搏app下载Aequorea victoriaGFP是突出的，可以看作是一个连接器(图1)。事实上，对于一些FRET生物传感器(黄色变色3.60，EPAC,Galphai)，可以截断供体荧光蛋白的c端和n端，以提高荧光检测效率。
在你感兴趣的蛋白质的N和C末端产生融合
最直接的融合蛋白是通过连接荧光蛋白的N或c端与感兴趣蛋白(POI)。为了表示序列，人们经常使用“c端融合”这样的术语，但我发现这非常令人困惑，因为它可能意味着荧光蛋白在POI的c端或者POI在荧光蛋白的c端。我更喜欢描述从N端到c端融合的不同部分。例如，Lifeact-mTurquoise2 (质粒# 36201)或mScarlet-tubulin (质粒# 85045)．
我们常用限制性内切酶在多克隆位点进行融合。对于poi荧光蛋白融合，我们的经验是4个氨基酸的连接(PVAT，当我们在多个克隆位点使用AgeI位点时)就足够了。对于荧光蛋白- poi融合，我们产生了直接融合，没有任何连接子。
当两个方向都可用时，对这些融合蛋白的直接比较可能揭示哪一个更好地保留了POI的功能。例如，APT1-mVenus融合定位于高尔基体，而mVenus-APT1融合不定位于高尔基体(图2)。在mVenus-APT1中，高尔基体定位所需要的脂化motif被阻断，因此该蛋白定位错误。APT1-mVenus核聚变显然是更好的选择。
在你感兴趣的蛋白质中插入荧光蛋白
我们已经遇到了一些蛋白质，它们的N-和c端是POI的固有特性所必需的。在这些情况下，荧光蛋白插入POI可以很好地工作，因为荧光蛋白的N-和c端残基相对接近(图1)。
荧光蛋白应该插入哪里?那些不太可能破坏POI结构的站点工作得最好。理想情况下，结构化信息可以指导这一决策。根据我们的经验，插入的最佳位置是在二级结构(-片或-螺旋)之间的循环。另一个要求是插入位点不与其他蛋白质或生物分子相互作用。成功插入荧光蛋白的例子有Ccd42 (Bendezú等，2015)和异三聚g蛋白的α亚基(Janetopoulos等人，2001年，Adjobo-Hermans等，2011)．
虽然结构信息可以指导设计，但是建议使用不同的插入生成多个结构，因为很难预测哪个结构会像图3 (Mastop等人，2018年)．可以使用基于转座子的策略产生无偏置、随机插入(谢里登,2002)．
避免蛋白质过度表达
对融合蛋白进行编码的DNA的引入将蛋白质添加到细胞内现有的蛋白质库中，并可能导致过度表达的假象。这是该技术的一个重要缺点，在解释结果时应始终考虑到这一点。
最近基因组编辑方法的革命(最值得注意的是CRISPR / Cas HDR介导的)使内源性基因标记接近原生表达水平。然而，建议首先从质粒系统中表达融合蛋白，以评估嵌合体是否仍然具有功能。
关于荧光蛋白融合的最后一句话
在生成融合蛋白之前，有几个选择需要考虑，例如连接子长度、特定的荧光蛋白变体以及在哪里添加荧光标签。这些选择将决定融合在多大程度上反映了被标记的天然蛋白的功能。融合蛋白的定位可以被验证，它可以与基于免疫荧光或蛋白质特性的预期进行比较。
确定功能的其他方面(催化活性或相互作用)可能是一项挑战。如果融合能补充相应蛋白质的敲除或敲除，那就有力地证明融合表现良好。但这并不能证明融合与天然蛋白质的运作方式相同。尽管荧光蛋白融合可能永远无法与未标记的蛋白发挥相同的作用，但能够看到感兴趣的蛋白的好处通常超过标记的潜在负面后果。
非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhart!
Joachim Goedhart是分子细胞学和Van的助理教授Leeuwenhoek先进显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发、表征并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart．
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