更新(2016年11月18日):来自不同机构的研究人员最近报告称，他们无法概述Gao等人2016年的研究结果给《蛋白质与细胞》杂志的一封信．
更新(2017年8月3日)本帖所讨论的NgAgo文章的原稿已被撤回跟踪研究没有证明这个工具可以编辑基因组
本文由客座博主Pooran Dewari贡献。这篇文章中的任何观点都是客座博主的观点，不一定代表Addgene的观点。Addgene对所有分布质粒的选定区域进行Sanger测序，作为质量控制的一部分，但不进行功能检测。
与备受赞誉的CRISPR-Cas9共享这一阶段的最新基因组工程师是dna引导内切酶NgAgo！我们将在一分钟内讨论NgAgo如何与用户相处，但首先，让我们回顾一下为什么NgAgo会成为聚光灯下的焦点，并花点时间记住NgAgo用于基因组编辑只有几个月的时间。要真正与CRISPR竞争，还需要更多的时间进行优化和开发。
令人兴奋的NgAgo功能
首先，与Cas9不同，NgAgo不需要PAM序列来识别目标，这给了研究人员以任何DNA序列为目标的前所未有的自由。其次，NgAgo的靶向特异性是由DNA引导序列决定的，而不是像Cas9那样由RNA引导。第三，它可以用于靶向基因组中“困难的”富含gc的区域，这些区域似乎对Cas9切割具有抗性(1）.
CRISPR-Cas9和NgAgo基因组工程方法都有各自的优缺点(2）.NgAgo DNA指南价格低廉，可以使用简单的PNK反应在内部进行5 ' -磷酸化，也可以从公司购买5 ' -修饰。然而，与RNA向导不同，它不能从细胞中的质粒中产生。此外,在体外NgAgo/ssDNA的组装需要在55℃孵育°对哺乳动物细胞来说，这是一种危险的、非生理的温度，会降低酶的内切酶活性。在活的有机体内在美国，只有新生的NgAgo蛋白(可能还在合成过程中)才能形成具有ssDNA引导的复合物。因此，研究人员必须将5 ' -P-ssDNA引导物和NgAgo表达质粒共转染细胞，以编辑基因在活的有机体内．
另一方面CRISPR-Cas9在多个模式生物中的广泛成功（3.)关键在于它的多样性交付方法．研究人员可以方便地转染/注射细胞在体外预先组装的Cas9/gRNA复合物或引导RNA和Cas9表达质粒。然而，Cas9引导RNA的传递依赖于克隆到载体或在体外合成，如果一个人必须在一个实验中针对多个位点，这可能是不理想的。此外，NGG PAM序列可能并不总是在距离目标位点的最佳距离可用。例如，NGG可能不存在于基因组的at丰富区域或终止密码子之后(如c端表位标记所需要的)。
NgAgo调查
自2016年5月首次发表于《Nat Biotech》(1)， NgAgo受到了广泛的关注，全球各地的实验室对质粒的需求已近400次。研究人员一直在兴奋地测试NgAgo的基因组编辑应用。那么，NgAgo目前的表现如何呢?几周前，我浏览了NgAgo谷歌论坛，在那里人们写下了他们使用新方法的经验，并寻求建议/提示。从论坛上的讨论来看，许多研究人员似乎很难用这项新技术实现indel形成(基因破坏)。为了进一步挖掘研究人员对NgAgo的感受，我进行了一次调查并询问研究人员是否对NgAgo和CRISPR-Cas9进行了面对面的测试和比较。该调查分为两部分，第一部分询问研究人员认为两种方法中哪一种更成功，第二部分询问受访者使用的NgAgo协议的基本问题(转染方法，每次转染每个成分的数量等)。
调查结果
截至2016年8月1日，共有165名研究人员回应这项调查。当被问及是否可以用NgAgo检测indel(一种基因破坏能力的指标)时，88名受访者中有1人确认在目标位点成功形成indel。此外，41名受访者尝试使用该技术进行表位标记，但只有一人能在目标位点检测到标签的敲入。总体而言，64%的研究人员对新方法不满意，65%的研究人员希望等待其他人为他们最喜欢的模型系统优化NgAgo协议。绝大多数受访者(70%)使用基于脂质体的方法将NgAgo成分输送到细胞中，与Gao等人2016年使用的方法相同(1）.
的关键信息
虽然大多数受访者一直在努力用NgAgo实现基因组编辑，但这并不意味着这项技术已经夭折。乐观的一面是，一些受访者成功地实现了indel生成和表位敲入，这表明NgAgo确实可以优化哺乳动物细胞的基因组编辑。然而，这里调查的大多数研究人员无法实现对NgAgo系统的插入，这表明它的使用非常棘手，优化也非常繁琐。其中一个原因可能是被认为是外来的5 ' -磷酸化的ssDNA向导的不稳定性，它可能会被细胞机制迅速降解，在细胞中留下少量活性的NgAgo/ssDNA复合物。正如原文章中提出的，为了达到更大的疗效，研究人员将不得不使用ssDNA引导进行重复转染，尽管许多人可能会发现这很不方便。NgAgo的另一个可能的原因是成熟的NgAgo蛋白无法加载ssDNA引导。有可能在翻译过程中，只有一小部分新生的NgAgo蛋白分子能够与ssDNA形成功能复合物，从而导致下游编辑效率低下。
总的来说，到目前为止，根据受访者的“最终结论”，我们需要更多的时间来优化NgAgo，然后才能得出任何重要的结论:
也就是说，许多人在使用NgAgo系统时遇到了困难。如果你已经取得了成功，我鼓励你与研究团体分享你的结果和协议。下面是一些可以让你得到结果的好地方:
- 谷歌Groups——我专门设立了一个论坛，NgAgo用户可以在这里分享协议和技巧
- Twitter -使用#NgAgo发布建议和提示
- Addg188博金宝官网ene博客-在下面的评论部分留下建议和提示或联系blog@addgene.org如果你想写一个更详细的帖子
这可能需要一段时间来优化NgAgo为你最喜欢的模型系统,但基因编辑领域迅猛发展,它不会是一个惊喜,如果有人想出了一个突变NgAgo(或一种新的核酸内切酶)蛋白能够形成一个复杂的和一个5 ' -P-ssDNA指导在室温下。在此之前，那些有幸使用NgAgo的人应该在NgAgo论坛、博客或下方评论区与科学界分享技巧和协议细节。继续移液，祝你基因组编辑愉快!
非常感谢我们的客座博主Pooran Dewari!
Pooran Dewari是爱丁堡再生医学MRC中心(CRM)的博士后。他的研究兴趣包括优化脑细胞基因组编辑方法和了解脑肿瘤生物学。不剪DNA的时候，他会尝试一些随机的事情(101节西班牙语课、c++、吉他、摄影)，经常梦想在爱丁堡度过一个阳光灿烂的日子。
参考文献
1.高，冯，等。"利用格里高利钠杆菌进行dna引导的基因组编辑"自然生物技术(2016)．PubMedPMID: 27136078．
2.伯吉斯,肖恩。,等。“关于NgAgo问题。”蛋白质与细胞(2016)．
3.NgAgo: dna引导酶的基因组编辑DNA-scissors(博客)。博客网站．
4.张峰，徐志伟，张志伟，张志伟。“CRISPR-Cas9基因工程的开发和应用”细胞157.6(2014): 1262 - 1278。PubMedPMID: 24906146．公共医学中心PMCID: PMC4343198．
参考资料在Addgene博客188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
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