热质粒和病毒准备- 2021年3月

通过各种Addgenies

各种Addgenies2021年3月23日

每隔几个月，我们就会通过我们的热质粒文章．这些文章提供了最近质粒沉积的简要总结，我们希望它们将使您更容易找到和使用您需要的质粒。

以下是您将在本帖中找到的内容：

单罐组装的表观遗传工程

虽然从测序的角度考虑DNA很容易，在活的有机体内研究应始终考虑DNA的染色质状态(图1a)。的实验室卡梅拉·海恩斯埃默里大学最近向库贡献了一组质粒，这将帮助表观遗传学研究人员在大约一周内定制设计他们自己的工程质粒工具。利用金门克隆海恩斯的实验室协议.io协议描述了一种优雅的系统，可以在一个“单一容器”中高效、准确地组装多个DNA片段。

细胞内的细胞核显示与染色的DNA链和组蛋白修饰酶和阅读效应蛋白的例子放大。下面是金门组装的示意图，包括潜在的合成染色介质和探针的例子。

图1:单锅组装:a)细胞核内染色质的图示-> DNA紧实在组蛋白周围->组蛋白修饰酶和阅读器效应蛋白的例子。b)带有潜在合成染色质介质和探针的金门组装(可在Addgene获得主干)。从图片Priode等人，2021年．

潜在的工具分为两类:探针和编辑器。探针阵列可能由至少两个传感器模块针对一个特定的染色质功能(如甲基化组蛋白如H3K27me3),这些模块之间的链接(链接器长度可以而且应该是不同的,因为它可以为融合蛋白功效具有重要意义),和可视化荧光蛋白标记(图1 b)。当探针靶向染色质以可视化DNA时，编辑器靶向DNA(通过催化失活的dCas9)来修饰染色质。出于可视化的目的，仍然可以包含荧光蛋白，但编辑组件的关键组件也是传感器-执行器转录监管机构或chromatin-modifying酶。速度和灵活性单罐系统将使研究人员能够快速、准确地合成多种合成染色质修饰蛋白。

Priode和Haynes，protocols.io.2021年。dx.doi.org/10.17504/protocols.io.brgcm3sw

一种追踪细胞间相互作用的新系统

通过詹妮弗曾

基于GFP的触控Nexus（G-baToN）是芮唐在年开发的一种新工具蒙特温斯洛的实验室在细胞间相互作用后标记细胞。使用G-baToN，“发送者”细胞在表面表达GFP，“接受者”细胞表面表达抗GFP纳米体。当细胞相互作用时，GFP转移到受体细胞，受体细胞变绿。该系统可用于多种细胞类型，包括内皮细胞周细胞、神经元星形胶质细胞和肿瘤基质细胞对。

sGFP发送方细胞编码一个表面GFP，该GFP与接收细胞上的抗GFP纳米体相互作用。发送方细胞为绿色，接收细胞为灰色。

图2:发送单元和接收单元之间的相互作用示意图。从图片Tang等人，2020年．

G-baToN还可以应用于其他荧光团/抗体对。由于抗GFP纳米体与BFP发生交叉反应，表达表面BFP的发送者细胞产生BFP标记的受体细胞。此外，G-baToN还可以用于携带蛋白质或DNA等货物，以操纵受体细胞的功能。目前有超过40万亿个细胞可以在其表面表达BFPke-up人体和G-baToN提供了追踪和调节细胞间相互作用的多样性。

Tang等人，eLife 2020。https://doi.org/10.7554/eLife.61080

一种新的植物生长素诱导降解(AID)系统工具包C．线虫

通过Alyssa Cecchetelli

生长素诱导脱胶（AID）系统已广泛应用于临床线虫自2015年起，我们开始有条件地降解细胞中感兴趣的蛋白质(Zhang et al.， 2015）.最近,沃德实验室创建一个工具箱在这些原始工具的基础上进行扩展，这些工具允许蛋白质的时空降解和使用基于成像的测量对这种损耗进行量化(Ashley等人，2021年）.

示意图显示了标记在感兴趣蛋白质上的AID。当生长素结合时，它会将一种蛋白质复合物带到感兴趣的蛋白质上，以蛋白质体降解为目标。

生长素诱导去铁素系统示意图Ashley等人，2021年．

AID系统依赖于在具有特定时空表达模式和生长素诱导脱辅基（AID）的所需启动子下表达的转运抑制剂反应1（TIR1）连接到您感兴趣的蛋白质的序列。TIR1与内源性Skp1和Cul3蛋白质相互作用，形成SCF E3泛素连接酶复合物。在存在生长素的情况下，该TIR1复合物与degron序列结合，最终导致AID标记的蛋白质降解。为了量化蛋白质降解，Ward实验室使用荧光蛋白EIN（FPs）与AID*（最小44个氨基酸的生长素诱导脱克隆序列）标记的蛋白质融合。你对蛋白质兴趣的降解也会导致FP的消耗，这很容易被观察到。金宝搏app下载

该工具包包括与Gibson和Saptrap克隆系统兼容的非常有用的载体，用于生成AID*标记的CRISPR敲入修复结构。这些修复结构可用于通过CRISPR技术将标记的AID*整合到感兴趣的基因组位点。该工具包包括一系列FPs以及其他有用的标签，包括3xFLAG表位、TEV和BioTag，可用于蛋白质亲和纯化研究。

Duong等人，遗传学，2021年。https://doi.org/10.1093/genetics/iyab006

CRISPR角

通过詹妮弗曾

以下是近期CRISPR质粒的一些亮点。要找到Addgene中所有可用的CRISPR质粒，请访问我们的CRISPR质粒和资源页面．

质粒Tonia Rex的实验室现在提供了通过单个AAV载体交付CRISPRi组件的方法。
vfCRISPR这是Taekjip Ha的实验室开发的一种光诱导CRISPR系统，Cas9-gRNA复合物结合目标DNA而不发生裂解，直到它被光激活。一旦被激活，Cas9分裂可以在几分钟内诱导双链断裂。
新CRISPR质粒为伯氏疏螺旋体产生不同水平的dCas9表达，并包含不同的抗生素耐药性标记。
新CRISPR池库现在可以从Keith Joung和Benjamin Kleinstiver的实验室获得这些文库。这些文库用随机核苷酸编码靶位点，取代原间隔基相邻基序（PAM）。它们用于确定Cas酶的PAM需求。
CRISPR-ARE是连家章实验室的一种新系统，它可以用一个Cas9-VPR在酿酒酵母．
为了控制Cas9活性并影响DNA修复途径，Amit Choudhary的实验室开发了一种chemogenetic系统将Cas9带到泛素连接酶中进行降解。