每隔几个月，我们就会通过我们的热质粒的文章．这些文章提供了最近质粒沉积的简要总结，我们希望它们将使您更容易找到和使用您需要的质粒。
以下是你会在这篇文章中发现的:
通过突变扫描绘制SARS-CoV-2抗体逃逸图谱
随着多种基于抗体的疫苗在世界各地部署，以抗击严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)，病毒可能获得突变，以逃避这些疗法。杰西·布鲁姆的实验室Fred Hutchinson癌症研究中心开发了一个包含病毒刺突蛋白受体结合域(RBD)所有可能的氨基酸突变的聚合质粒库。
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| 图1所示。(A) SARS-CoV-2 RBD DMS文库生成和测序。从Starr等Cell。, 2020年．(B)用酵母展示库绘制抗体逃逸突变图谱。从Starr等《科学》杂志。, 2021年． |
SARS-CoV-2通过结合人血管紧张素转换酶2（ACE2）细胞表面受体感染宿主细胞。负责结合ACE2的棘突蛋白RBD是大多数抗SARS-CoV-2抗体的靶点。在文库中，每个质粒编码突变的刺突蛋白和一个条形码，其设计使SARS-CoV-2刺突RBD显示在酵母细胞表面。Bloom实验室利用该文库鉴定RBD突变，这些突变不干扰ACE2结合，但影响特异性抗SARS-CoV-2抗体的识别（图1B）。这种方法可以通过快速评估抗原漂移来增强病毒监测。
Starr et al . Cell. 2020。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.012
斯塔尔等人的《科学》，2021年。https://doi.org/10.1126/science.abf9302
用于氨基酰tRNA合成酶的有效重组抗体工具箱
通过凯特Harten
以14个氨基酰基tRNA合成酶(aaRS)为靶点的重组抗体已经被制备、表征和验证Graslund实验室．最近的研究结果表明aaRSs与炎症和自身免疫性疾病有关，因此这些经过验证的抗体工具可以用来研究aaRSs在这些过程中的作用。
为了创建抗体工具箱，他们使用合成的人类单链抗体库筛选候选抗体，并通过ELISA、均匀时间分辨荧光和悬浮珠分析对其进行表征（图2）。在发现没有交叉反应后，候选抗体进行亲和筛选，以选择慢反应率的结合物。最佳候选物通过IP-MS使用HEK293细胞裂解物进行验证，其中抗原将处于其天然构象。由于许多AARs存在于多tRNA合成酶复合物中，研究小组研究了产生的抗体是否能结合这些AARs。他们发现抗体能够在三种不同的细胞系中免疫沉淀整个复合物。Gräslund实验室计划通过产生额外氨基酰tRNA合成酶的抗体来继续他们的工作。
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| 图2:用悬浮珠法测定scFVs与同源aaRS抗原的特异性结合。从图片Preger等人，2020年。 |
Preger等，生物化学学报2020。https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.01289
新型蛋白笼在酵母生物生产途径中提供简单的酶保护
克劳迪娅维氏的实验室利用小鼠多瘤病毒样颗粒(MPyV VLPs)，创造了一种新型纳米室，用于在酵母中运输蛋白质。这种人工纳米颗粒可以保护蛋白质不受细胞内不利相互作用的影响，通过稳定限速酶来提高生物合成途径的产量。在这种方法中，主要的衣壳蛋白VP1与包含VP2C的融合蛋白和一个感兴趣蛋白(POI)共同表达。VP2C融合蛋白锚定在VP1上，VP1自组装成一个包覆感兴趣蛋白的腔室(图3)。
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| 图3:MPyV系统的示意图。图片来自Cheah等人，2021年。 |
在通过监测GFP降解验证该方法后，利用该蛋白室优化d -葡萄糖酸的生物合成。这种MPyV系统在该途径中封装了一种限速酶(肌醇加氧酶)，在提供酶保护的同时，仍允许底物和产物自由扩散进入或离开蛋白质室。含有这种封装酶的酵母可以多生产20%的d -葡萄糖酸，这表明MPyV系统可以通过封装单一酶来提高代谢途径的产量。以往的研究需要蛋白室在反应途径中对多种酶进行共定位，相比之下，MPyV系统提供了一种简单、有效的方法来保护驱动生物合成途径的单一酶。
Cheah等人，bioRxiv 2021。https://doi.org/10.1101/2021.01.30.428974
CRISPR角
通过詹妮弗曾
以下是最近CRISPR质粒的一些亮点。要找到Addgene提供的所有CRISPR质粒，请访问我们的CRISPR质粒和资源页面．
- 一种新的系统利用光线来解除激活机油包裹gRNAs在几秒钟内。
- 一个基于crispr的谱系跟踪工具捕获占种群0.001%的稀有克隆。
- 由于Cas9能以稳定的速度产生indel，科学家们找到了一种利用indel积累来测量时间的方法。这些不同启动子驱动Cas9表达的质粒在本研究中使用。
- 的zCas9i克隆工具是一种植物克隆试剂盒，包含一系列用于组装CRISPR/Cas9结构的载体和DNA模块。zCas9i是一个高效内含子优化的spcas9编码基因。
- SlugCas9紧凑的Cas9同源物来自哪里葡萄球菌lugdunensis识别NNGG PAM并具有与SaCas9类似的活性。
- 一个新的酵母诱导CRISPRi文库——Ampl133目标年代．酵母每个基因有6-12个引导基因，其中gRNA表达由无水四环素诱导。
- 三个新的anti-CRISPRs被发现抑制了年代．葡萄球菌Cas9是一种更小、更容易传递的Cas蛋白，但到目前为止还没有发现多少抑制剂。
病毒式传播服务的最新消息
通过杰森Nasse
我们定期从我们的质粒收集中添加新的病毒等量来提供现成的病毒预备．以下是近几个月来的一些新的病毒准备:
- 轴突的目标GCaMP6f来自林甜实验室的AAV1血清型
- 贾内利亚农场的GCaM188完整比分直播P8病毒载体精灵项目已经到达!我们现在提供几个版本的GCaMP8向量在AAV1和AAV5血清型中AAV9准备和更多的AAV1版本将很快发布。
- 用一个载体形象化轴突投影和假定的突触前终端。AAV hSyn FLEx mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby从金立群罗的实验室表达膜系GFP增强轴突标记，突触素标记mRuby增强突触前标记。现在有血清型AAV1!
- 新的INTRSECT病毒准备可用!我们正在扩大库存准备使用来自戴瑟罗斯实验室INTRSECT项目。我们现在有超过40个INTRSECT 2.0项目载体可作为随时可用的病毒准备，更多的在路上。
- 含S5E2调控元件的载体在Jordane Dimidschsteind实验室选择性地在含有小白蛋白的皮质中间神经元中表达。我们现在用这个启动子提供了表达GCaMP6f的现成AAV载体。在PV中间神经元中成像钙瞬变AAV-S5E2-GCaMP6f现在可以作为AAV1血清型的现成病毒准备剂。
- 利用AAV载体表达质粒靶向tdTomato和突触前靶向synaptophysin标记的eGFP来区分树突神经突起和轴突神经突起。AAV phSyn1 -FLEX-tdTomato-T2A-SypEGFP-WPRE(年代)从Hongkui曾庆红的实验室现在可以作为AAV1血清型的现成病毒准备。
- 针对GCaMP6s突触从不是拉森实验室现在已经有现成的AAV5病毒载体。突触素标记的GCaMP6s在突触前末端富集，为精细结构中的钙动力学成像提供更好的噪声信号。
- 我们扩大了重组酶依赖的病毒选择，现在包括Flp-dependent DREADDs188完整比分直播病毒载体。来自Gether实验室的抑制性和兴奋性dreadd现在可以作为血清型AAVrg的现成AAV载体。
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