热质粒：基于FRET的生物传感器

奥利弗GriesbeckMax Planck神经生物学研究所一直致力于自领域的开始以来的遗传编码的钙和其他小分子的指标。这些工程传感器旨在取代自20世纪80年代以来一直在使用的合成钙染料。

“合成染料是这一领域的标准，但有一个问题:如何将其进入感兴趣的细胞，”Griesbeck说。因为它们是化合物，它们必须被应用或注射，它们并不总能达到你想要的结果。

Griesbeck对监测活神经元的活动和生物化学特别感兴趣，试图理解分子和细胞水平的事件和行为之间的联系。他认为这个问题是“神经科学最大的挑战之一”。

热质粒：抽搐传感器

Griesbeck最近在该领域的贡献是一系列基于荧光共振能量转移(FRET)的钙生物传感器．也许最值得注意的是抽搐钙传感器，可在Addgene上获得，可用于比率计量体内成像。Griesebeck解释说，虽然这些抽搐传感器总是光明的，但它们在钙的存在下从“OFF”转移到“ON”时改变颜色。可以使用市售的分束器分离器在显微镜下观察到这种颜色变化。除了成像神经元之外，Gresbeck还增加了这种颜色变化具有观察在移动的细胞内发生的事件，例如T淋巴细胞。

Gresbeck和他的同事通过分离钙结合蛋白质，肌钙蛋白C（TNC），从肌肉细胞中开始。他们发现了一种蟾蜍鱼的TnC变体，这种变体具有高亲和力的钙结合和发展蛋白质的一种形式，其具有尽可能少的钙结合位点，以增加敏感性。

在报道自然方法，通过在一个大规模的细菌功能屏幕中测试各种连接器配置，这些Twitch传感器变体的FRET变化得到了优化。然后通过在大鼠海马神经元培养中进行二次筛选来改进传感器变异。优化后的Twitch传感器让研究人员可以看到神经元中的强直动作电位，也可以看到T淋巴细胞的高分辨率功能跟踪一种用于神经科学和免疫学的多功能工具．

不要害羞：初学者的比例成像

Griesbeck说他的钙指标可以用在老鼠身上，果蝇，秀丽隐杆线虫,以及斑马鱼——基本上所有的标准生物都有广泛的基因工具可用。虽然他认识到一些初学者可能有回避比率成像的倾向，但他建议他们尝试一下。

“初学者有时认为它很复杂，但实际上它非常好，”他说。“它给你的信息比基于强度的读数更多。”

Griesbeck还指出了他和他的同事的方法优化灵敏度现在可以应用于其他几十种已发表的基于fret的传感器．例如，他的团队现在将其应用于他们开发的指标和在2010年出版在活细胞中可视化转录因子camp响应元件结合蛋白(CREB)。

“现在我们做得很好，”Griesbeck说。“我们知道CREB真的很重要，但它在何时何地真正重要?这还不清楚。”

过渡金属

Maarten Merkx埃因霍温理工大学的研究人员对基于fret的传感器蛋白也有类似的兴趣，特别是对过渡金属离子(如锌、铜和铁)的细胞内成像。

“这些是必需的金属离子，但它们也是有毒的，”Merkx解释说。需要新的工具来测量它们。

Merkx说,w原则上，采用用于监测钙的FRET传感器，与锌相对于锌，应该需要简单地交换绑定域，在实践中，优化传感器涉及大量的试验和错误。过渡金属也存在挑战，因为它们在比钙的浓度远低得多的细胞中发现，需要更大的灵敏度。

他和他的同事提出了一个解决方案：他们设计了自相关联的荧光域，其关联在存在配体存在下破坏（它们在一个状态下粘在一起，而不是另一个状态）。

他说:“这是一种相当稳健的方法，可以制造具有大动态范围的FRET传感器。”Merkx最近将这种“技巧”应用于额外的颜色变种．这导致建设Redcalwy-1，一个红移烦恼传感器对于使用Morange2和MCHERRY的变体作为供体和受体结构域的锌。他说，这些新的颜色现在可以观察不同分子之间的相互作用，比如锌和钙。

最终，Merkx表示，他希望其他人会发现他的工具有用，包括他的锌传感器和他的遗传编码的镁传感器，首先。

“我希望通过存放在addgene中，人们将开始使用它们，”Merkx说。“对我们来说，它是成功的主要措施之一- - - - - -无论我们是否真的开发了一些有用的东西[足够]其他人开始使用它。对我们来说，这就像一个测试。“

参考

• Thestrup et al。优化的比例钙传感器在神经元和T淋巴细胞的体内成像功能。NAT方法。2014年1月5日DOI：10.1038 / nmeth.2773。（PubMed）
  
  
• Friedrich等人。在活细胞中成像CREB激活。J Biol Chem。2010年7月23日; 285（30）：23285-95。DOI：10.1074 / JBC.M110.124545。（PubMed.）
  
  
• 林登堡等人。使用自关联荧光域的稳健红色FRET传感器。ACS Chem Biol. 2013 Oct 18;8(10):2133-9。doi: 10.1021 / cb400427b。2013年8月30日。（PubMed）
  
  
• 林登堡等人。MagFRET:首个基因编码荧光Mg(2+)传感器。公共科学图书馆。2013年12月2;8(12):e82009。doi: 10.1371 / journal.pone.0082009。（PubMed）

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