这篇文章由客座博主Jon Backstrom贡献，范德比尔特眼科研究所的生物化学家和妮娅雷克斯的实验室．
确定纯化蛋白的结合动力学的一般策略包括在固体载体上固定。这允许洗涤掉未结合的物质来计算结合配体的数量(减去非特异性结合后)。从历史上看,glutathione-S-transferase(销售税)融合蛋白已被还原的谷胱甘肽基质固定。融合蛋白的优点是可以有效地纯化已经固定的靶蛋白。缺点是形成二聚体的GST部分可能会影响目标配体的结合动力学。另一个重要的考虑是，实验蛋白与配体相互作用的亲和力是否接近gst -谷胱甘肽。
基于生物素的固定化动力学分析
融合蛋白的蛋白水解去除可以提供更相关的动力学分析，但诀窍是利用第二种固定化方法。一种可能是用维生素生物素对纯化的目标蛋白进行共价修饰。生物素与蛋清蛋白亲和素(或其衍生物链霉亲和素和中性亲和素)之间的相互作用实际上是共价的。因此，通过生物素-亲和素结合的蛋白质固定化可以提供高亲和力(即亚纳米摩尔)的蛋白质-配体相互作用的真实测量。亲和素及其衍生物每个分子有4个生物素结合位点，因此，理论上，饱和的亲和素可以形成生物素化蛋白的四聚体。然而，生物素化蛋白在亲和素上的低聚化比GST二聚体的形成更容易控制。
提高生物素化选择性的Avi-Tag质粒
生物素酰化蛋白的一个常见策略包括胺反应生物素衍生物，它与带正电的氨基酸形成共价键。不幸的是，生物素掺入的位置和在较小程度上，每个分子添加生物素的数量不能很好地控制。缺乏位点选择性通常会降低配体的表观亲和力，特别是当修饰的胺位于配体结合位点附近时。一种选择性的方法需要使用生物素连接酶，它与蛋白质中的一个小(< 20个氨基酸)AviTag序列结合，并将生物素添加到AviTag中的赖氨酸残基中。然而，至少由于生物素化效率相对较低，通常需要大量的靶蛋白在体外．
我们的解决方案是充分利用两个世界的优点。我们生成了一个产生生物素连接酶的质粒和一个融合到麦芽糖结合蛋白(MBP，新英格兰BioLabs)的蛋白。MBP具有与GST相似的功能，因为它提供了一种在细菌中表达外源蛋白并随后从细菌提取物中纯化融合蛋白的方法。MBP标签可以用Xa蛋白酶去除。融合蛋白的羧基末端包括一个AviTag和一个用于亲和纯化的6X HisTag(见下面的质粒图和卡通)。在你的培养基中加入生物素，用IPTG诱导蛋白表达，结果是在活的有机体内生物素酰化。共同表达的连接酶将使AviTag中的赖氨酸残基生物素化。顺便提一下，我们发现添加TEV连接子极大地增加了AviTag和HisTag的可及性，这两种蛋白被“埋没”在一些缺乏TEV的蛋白中。虽然我们无法在我们测试的蛋白质中切割TEV，但它可能与其他融合蛋白一起——但它将移除AviTag和HisTag。
令我们惊讶的是，我们找不到一种一体化的质粒，它提供了一种简单的方法来将细菌中的融合蛋白生物素化。我们最初的尝试是基于生物素连接酶BirA骨干(Eric Campeau, Addgene plasmid #26624)是不成功的。最令人高兴的是，到了最后一步，转化后的细菌拒绝生长。最终的成功是将BirA插入pMal质粒(内)由此产生了pMal-T-Avi-His / BirA质粒现在可以通过Addgene获得。
我们已经成功地使用这个质粒来生物素化红细胞生成素受体的胞外区域，并随后评估了与突变型和野生型红细胞生成素分子的相互作用。的在活的有机体内这里概述的生物素化和纯化策略为使用多种方法确定结合动力学提供了基础，包括表面等离子体共振(Biacore, GE生命科学)或生物层干涉测量(Octet, Pall ForteBio)．
使用pMal-T-Avi-His/BirA添加生物素到你感兴趣的蛋白质的提示
- 在NEB T7 SHuffle菌(C3029J)中培养融合蛋白质粒。我们显然是NEB的“粉丝”，因为这种细菌显著地增强了蛋白质的折叠(通过真正的科学测试)。
- 制作2.5 mM生物素(50X)的原液，因为5 mM在室温下几乎不溶解。
- 链霉亲和素磷酸酶印迹生物素化蛋白的跟踪表达和纯化(Jackson ImmunoResearch, 016-050-084;0.2μg / ml决赛)。抗MBP的兔(EMD, AB3596)和小鼠(NEB, E8032S)抗体均已上市。
- Xa因子喜欢钙，但不喜欢金属螯合基质。也许一个不依赖钙的蛋白酶位点可以用于质粒2.0版本?
- 像八隅体这样的仪器可能需要更少在活的有机体内-生物素化蛋白(总量)相对于使用较低效方法进行生物素化的蛋白。
非常感谢我们的客座博主乔恩·巴克斯卓。
Jon Backstrom博士是范德比尔特眼科研究所的生物化学家，他对细胞信号传导特别感兴趣。
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