整合:利用crispr转座子的细菌基因组工程

这篇文章是由客座博主Leo Vo撰写的，他是哥伦比亚大学医学中心Sternberg实验室的博士生。

DNA转座子是无处不在的遗传元素，能够在基因组内部和基因组之间传播，并已被广泛应用——作为遗传研究的突变工具(例如使用水手)，作为下一代测序管道的标记方法(如使用Tn5)，以及作为人类疗法的敲入工具(例如使用睡美人）.尽管DNA转座子的用途多种多样，但由于其有限的可编程性而受到阻碍:根据所涉及的转座子，它们要么随机插入，要么在固定的基因组靶位点插入。

这一障碍最近被Sternberg和Zhang实验室发现的crispr -转座子所超越(Peters et al.， 2017;kompe等人，2019;Strecker et al.， 2019)，直接rna引导的转位。通过天然结合转座酶的DNA整合能力和CRISPR-Cas的目标可编程性，这些系统代表了下一代高效和可编程的工具，将大的DNA货物插入细菌基因组。Sternberg组将这种新功能命名为integration (Guide RNA-Assisted Targeting Insertion of Transposable Elements by Guide RNA-Assisted Targeting)， Zhang组将其命名为CAST (CRISPR-associated Transposase)。

CRISPR-transposons机制

crispr -转座子系统之一斯特恩伯格实验室来源于霍乱弧菌（霍乱弧菌集成(以下简称VchINT)并编码I-F型CRISPR-Cas系统。rna引导DNA整合所需的四种主要成分为(图1A，上):

1. 由32 nt间隔序列指定靶点的CRISPR RNA (crRNA)。
2. 四种蛋白质(TniQ, Cas8, Cas7, Cas6)与crRNA一起形成QCascade dna靶向模块。
3. 三种转座酶蛋白(TnsA, TnsB, TnsC)。
4. 供体DNA(又称迷你转座子)，它包含感兴趣的DNA货物，两侧有~50-150 bp的转座子末端序列(R和L末端)。

I型CRISPR-Cas系统需要多个Cas蛋白来形成级联靶向复合物，这与II型系统(如CRISPR-Cas9)使用的单一蛋白效应剂不同。然而，与常规的I型CRISPR-Cas系统不同，VchINT的级联并不招募其他核酸酶(如Cas3)或具有自己的核酸酶活性。相反，它与转位蛋白TniQ形成一种新的复合物用于靶向(Halpin-Healy et al.， 2020)。基因组目标需要一个上游2 bp的PAM序列进行QCascade识别;虽然5 ' -CC-3 '是VchINT最好的pam之一，许多其他pam也被该系统有效地识别。

在crRNA的引导下，QCascade复合物检测基因组并使用RNA-DNA碱基配对结合目标DNA序列。TnsABC与迷你转座子形成转座酶复合物，并将其从供体分子中切除，插入QCascade结合的基因组靶位点下游约50 bp(图1B)。这个过程还会产生一个5 bp的靶位点复制(TSD)，这是tn7家族转座子的标志性特征。迷你转座子的插入可以发生在两个不同的方向，但强烈偏向T-RL，其中R端接近目标位置(kompe等人，2019,Vo等人，2020)。

V-K型crispr -转座子系统的功能与I-F型非常相似，但它使用一个Cas12k蛋白而不是三个Cas蛋白(图1A，下)，并且只需要两个转座子蛋白(TnsB和C)。V-K型系统经常产生脱靶DNA插入和中间结构，称为协整合(Vo et al.， 2020;Strecker等人，2020年)。

用于细菌基因组工程的crispr转座子

在Sternberg小组关于VchINT的最初报道中，三个独立的质粒和多个启动子被用来表达必要的成分大肠杆菌(kompe等人，2019)。最近,实验室引入了一种精简的表达式方法(图2A)，涉及双质粒或单质粒系统(Vo et al.， 2020)。在双质粒系统中，效应质粒(pEffector)在同一个启动子下表达所有7个必需基因和CRISPR RNA，而供体质粒(pDonor)编码迷你转座子。pEffector和pDonor也可以组合在单质粒integration (pSPIN)中，为更小的货物提供简单的转换，并能够在整合后轻松治愈质粒细胞。

图2:(A) Streamlined VchINT表达式结构。(B)在两种不同的孵化温度下，VchINT实现了高集成效率。数据改编自Vo等人，2020年。

在大肠杆菌在美国，新的流线VchINT系统被证明可以催化10 kb大小的迷你转座子插入，效率为90-100%(图2B)， >对靶特异性为99%。此外，通过平行表达多个crrna(图3)，可以实现多个不同靶点的多路插入(Vo et al.， 2020)。VchINT也被证明在各种感兴趣的革兰氏阴性细菌宿主中具有活性，包括在混合群落中以及在以前没有培养或分离的物种中(Rubin et al.， 2020)。

图3:I-F integration型的多重插入，使用一个包含多间隔CRISPR阵列的单个质粒。

工作流和技术考虑事项

在细菌基因组中进行插入诉霍乱集成系统遵循一个简单的工作流程:

1. 将间隔体克隆到CRISPR序列中
2. 克隆所需的DNA货物到迷你转座子中
3. 将质粒转化为细胞并在培养皿中过夜
4. 通过表型或PCR/测序筛选菌落

虽然crispr -转座子功能强大，使用简单，但用户应该注意一些重要的细节。转座子在转位过程中要被特异性识别，基因载体必须位于L端和R端两侧，因此，与同源重组不同，无疤痕插入目前是不可能的。此外，这些转座子还表现出所谓的靶免疫，因此使用相同转座子的多个近端插入会降低效率(Vo et al.， 2020)。

CRISPR工具箱中的CRISPR转座子

rna引导的转座是令人兴奋的新增加的增长CRISPR工具箱以及更成熟的工具，如cas9重组，CRISPRa/i和碱基编辑。利用不同生物元件之间的独特结合，crispr -转座子擅长于在一个或多个所需基因组位点上，即使是非常大的遗传货物的可编程插入。这些系统的许多应用已经得到证实，从大规模基因组插入和/或删除，到多基因敲除(Vo et al.， 2020)，再到代谢盒的多拷贝基因组整合(Zhang et al.， 2020);然而，crispr转座子的技术潜力尚未完全实现。

非常感谢我们的客座博主Leo Vo!

Leo Vo目前是哥伦比亚大学医学中心Sternberg实验室的博士候选人。他目前研究CRISPR生物学和CRISPR基因组工程技术。在推特@Vopinator上留言或关注他。

引用:

Halpin-Healy TS, Klompe SE, Sternberg SH, Fernández IS(2020)通过转座子编码的CRISPR-Cas系统靶向DNA的结构基础。自然577:271 - 274。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1849-0

Klompe SE, Vo PLH, Halpin-Healy TS, Sternberg SH(2019)转座子编码CRISPR-Cas系统直接rna引导的DNA整合。自然571:219 - 225。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1323-z

Peters JE, Makarova KS, Shmakov S, Koonin EV(2017)通过tn7样转座子招募CRISPR-Cas系统。美国国家科学院学报114:E7358-E7366。https://doi.org/10.1073/pnas.1709035114

Rubin BE, Diamond S, Cress BF, Crits-Christoph A, He C, Xu M, Zhou Z, Smock DC, Tang K, Owens TK, Krishnappa N, Sachdeva R, Deutschbauer AM, Banfield JF, Doudna JA(2020)微生物群落内细菌的靶向基因组编辑。bioRxivhttps://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.17.209189v2

Strecker J, Ladha A, Gardner Z, schmidburgk JL, Makarova KS, Koonin EV, Zhang F (2019) crispr相关转座酶的rna引导DNA插入。科学365:48-53。https://doi.org/10.1126/science.aax9181

Strecker J, Ladha A, Makarova KS, Koonin EV, Zhang F(2020)“rna引导DNA插入与crispr相关转座酶”的评论。科学368:eabb2920。https://doi.org/10.1126/science.abb2920

Chen EE, Acree C, Wang HH, Sternberg SH (2020) CRISPR rna引导整合酶用于高效、多路径的细菌基因组工程。生物科技Nat》。https://doi.org/10.1038/s41587-020-00745-y

Zhang Y, Sun X, Wang Q, Xu J, Dong F, Yang S, Yang J, Zhang Z, Qian Y, Chen J, Zhang J, Liu Y, Tao R, Jiang Y, Yang J, Yang S (2020) multi - copy Chromosomal Integration Using CRISPR-Associated Transposases。ACS Synth Biol 9:1998-2008。https://doi.org/10.1021/acssynbio.0c00073

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