想象一下，我们能够确定两个蛋白质之间的距离是否在10纳米以内，或者测量蜘蛛丝螺旋结构的张力，或者突触中蛋白质的活动。什么样的工具使我们能够测量这些特性，什么样的有趣的实验可以进一步推动这些工具?所有这些事情都可以使用FRET完成!继续阅读，了解更多关于这一惊人的成像技术，并进一步探索在你的实验中使用FRET的提示．
你说的烦恼是什么?
F差劲的ResonanceE能量T转移（FRET）最初由Theodor Förster在1948年描述为更常见的荧光发射的变化。FRET与荧光分子的广泛使用，包括金宝搏app下载，导致了另一种缩写形式FluorescenceResonanceE能量Transfer。与典型的受激荧光团的激发和发射不同，FRET涉及从受激供体荧光团到受体荧光团的非辐射能量转移(即不发射光子)。FRET的典型步骤是:
1.通过吸收光子激发供体荧光团
2.能量从被激发的供体直接转移到受体荧光团——把它想象成一个虚光子
3.通过发射具有特定于受体波长的光子使受体荧光团弛缓回基态
为了使FRET发生，必须满足几个约束条件。供体和受体荧光团必须相容，以便供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱重叠。否则从供体转移过来的能量将不能激发受体。除了足够的光谱重叠，荧光团必须位于彼此1-10nm的范围内，并通过偶极-偶极相互作用进行适当的能量转移。
对于给定的供体-受体对，FRET效率可以测量，且FRET效率的变化与FRET对的距离和/或方向的变化相关。由于许多生物过程发生在典型的FRET范围内，因此，FRET效率被用来推断荧光团之间的相互作用，并作为一个小尺度尺来测量对于传统光学显微镜来说过于微小的距离。
不要烦躁——用这些烦躁资源代替吧!
由于荧光团对的选择是FRET实验的一个关键考虑因素，鉴于可用的荧光蛋白种类繁多，这种可能性似乎是压倒性的。幸运的是，几篇优秀的评论整理了各种论文的数据，使决策更容易。金宝搏app下载
1.Müller，Sara M.等人，“通过监测活体植物细胞中的致敏发射，对Förster共振能量转移进行量化。”（2013年）。PubMedPMID: 24194740．公共医学中心PMCID: PMC3810607．
2.等。荧光蛋白FRET配对指南传感器16.9(2016): 1488。PubMedPMID:27649177．公共医学中心PMCID: PMC5038762．
3.乔治·亚伯拉罕,波宾。,等。“基于荧光蛋白的FRET对荧光寿命测量的改进动态范围。”《公共科学图书馆•综合》10.8（2015）：e0134436。PubMedPMID: 26237400．公共医学中心PMCID: PMC4523203．
许多含有荧光蛋白的空载体在我们的金宝搏app下载担心资源页面并可用于与感兴趣的基因进行融合。这些质粒对于构建分子间荧光探针非常有用，在这种探针中，供体和受体荧光团融合到两个单独的蛋白质上。(相比之下，分子内荧光探针包含同一蛋白质上的供体和受体荧光团，当一个过程影响探针的构象时非常有用。关于这些生物传感器的更多内容将在后面介绍)。利用分子间荧光探针的实验通常通过测量荧光探针效率的变化来研究蛋白质之间的相互作用，由此可以推断出关于两个蛋白质接近程度的结论。
分子间荧光效应在实验上很难实现，因为受体与供体融合的比例随转染效率的变化而变化，任何未配对的荧光蛋白都可能对测量产生额外的干扰。金宝搏app下载如果供体蛋白和受体蛋白的距离或方向不是最优的，即使两个蛋白形成一个复合物，也可能不会发生或检测到FRET。
帮助排除实验设置在次优或不可检测的FRET中的潜在错误来源，特征良好为参考标准可用于验证FRET测量结果，并作为一种阳性对照。在供体-受体方向不利限制FRET效率的情况下，圆形排列(贝尔德等人，1999年)的荧光蛋白(即在不改变蛋白质中氨基酸顺序的情况下重新排列起始和结束位置)可能能够提高FRET效率。
在构建自己的FRET探测器之前，尝试搜索PubMed有关描述您正在寻找的FRET工具的文章，请查看我们的生物传感器列表另外，另一个实验室可能已经制造出了你需要的传感器。FRET生物传感器设计用于测量特定的小生物分子或基因活性，通常是分子内探针，因为供体和受体之间的连接序列对环境变化敏感，而环境变化会改变FRET效率。用分子间探针检测特定的细胞变化通常是不切实际的(对于非蛋白质的生物分子)或者会扰乱你想要测量的内源性状态(转染后基因或蛋白质的过表达)。
未来的烦恼
首个基因编码的FRET生物传感器，Cameleon (miyaaki等人，1997年)，用于测量细胞内钙，并于1997年发表。从那时起，在探针设计、荧光蛋白和显微镜设备方面的众多进步，增强了实验室回答细胞过程复杂问题的能力。金宝搏app下载目前，FRET实验可以探测蛋白质-蛋白质相互作用，测量小分子的浓度或活性，检测细胞过程和信号级联，量化机械张力(一个分子“弹簧”)(孟等，2008)，以及监控神经元活动(电压传感器)等等。
在Addgene的生物传感器页面上找到许多基于fret的生物传感器
最近的创新已经证明了单分子FRET在活细胞生物分子成像中的应用(Sustarsic和Kapanidis 2015)，这可能会导致监测活动物的这些过程(Hirata和Kiyokawa 2016)，以及分子张力显微镜(MTM)，它可以监测物理应力甚至施加的力(盖拉德和博吉2016)转化为选定的蛋白质。克服目前的限制，允许同时使用多个FRET生物传感器，将进一步增加细胞过程中可获得的相关信息的数量。FRET实验有望继续有助于我们对疾病的理解，甚至有助于药物的发现。
工具书类
1.王志强，王志强，等。绿色荧光蛋白内的环状排列和受体插入金宝搏app下载美国国家科学院院刊96.20(1999): 11241 - 11246。PubMedPMID: 10500161．公共医学中心PMCID: PMC18018．
2.miyaaki, Atsushi等。基于绿色荧光蛋白和钙调素的钙离子荧光指示剂金宝搏app下载自然388.6645(1997): 882。PubMedPMID: 9278050．
3.孟，樊杰，等。“一种基于荧光能量转移的机械应力传感器，用于在原位检测特定的蛋白质。”2月期刊275.12(2008): 3072 - 3087。PubMedPMID: 18479457．公共医学中心PMCID: PMC2396198．
4.Sustarsic, Marko和Kapanidis, Achillefs N。“带着统治者走进丛林:单分子FRET，了解活细胞的生物分子结构和动力学。”结构生物学的最新观点34 (2015): 52-59. PubMedPMID: 26295172．
5.平田，Eishu，喜横川，悦子。“单分子FRET生物传感器和活体FRET显微镜的未来展望”。生物物理期刊111.6(2016): 1103 - 1111。PubMedPMID：27475975．
6.盖拉尔、夏琳和博吉、尼古拉斯。“基于FRET的分子张力显微镜。”方法94(2016): 33-42。PubMedPMID: 26210398．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
更多资源请访问Addgene.org
留下你的评论