用CRISPR系统分离感兴趣的基因组区域

虽然大部分CRISPR研究都集中在基因组编辑上，但在没有基因组改变的情况下，使用Cas9核酸酶已经有了许多发现。这些研究利用了一种被称为dCas9的催化非活性形式(Jinek等人，2012）.和Cas9一样，dCas9可以通过靶向gRNA与特定的DNA序列结合。但是dCas9不能切割DNA。使用dCas9的很多研究都集中于利用与转录激活因子(如VP64)的融合进行转录激活(吉尔伯特等人，2013年)，或通过结合启动子区域抑制转录激活因子的关联而抑制转录(等，2013）.然而，dCas9与蛋白质标签的融合可以分离出gRNA靶向的基因组区域。

crispr介导的特定基因组区域的纯化

在2013年,藤井裕久Hodaka实验室首先描述了一种使用CRISPR系统纯化特定基因组区域的方法，该系统由dCas9和靶向gRNA组成，以识别该位点的分子相互作用(Fujita和Fujii, 2013）.他们称这种方法为工程dna结合分子介导的染色质免疫沉淀(enChIP)，因为任何工程dna结合分子，如锌指蛋白或TAL蛋白，可以使用。Fujii实验室在哺乳动物细胞中通过表达dCas9与n端3xFLAG标签(3xFLAG- dcas9)以及针对他们感兴趣的基因组位点，转录因子IRF-1的启动子区域的gRNA。使用针对3xFLAG标签的抗体进行免疫沉淀，使这些研究人员能够分离出带有结合基因组位点的dCas9，然后通过PCR进行确认。随后的质谱研究使鉴定与之相关的蛋白质成为可能IRF-1轨迹。

在此方法开发之前，分离一个特定的基因组区域是一个密集的过程。一种方法需要将识别序列插入基因组DNA，然后由DNA结合分子识别(星野和藤井，2009年）.其他形式的enChIP，不使用dCas9，要求锌指蛋白或TAL蛋白以特定的基因组位点为目标，可能需要多个克隆步骤(Fujita等人，2013年）.crispr介导的特定基因组区域的纯化缓解了这些问题，因为感兴趣的区域可以使用gRNA进行定位，而gRNA可以很容易地克隆到gRNA表达质粒中。

实验使用

自从最初的报道描述了crispr介导的特定基因组区域的纯化，该系统在不同的研究领域做出了许多适应。除了鉴定DNA结合蛋白外，该方法还可以在基因组位点上表征核酸-核酸相互作用(Fujita等人，2017年）.crispr介导的特定基因组区域的纯化最近也被用于分离细菌中的基因组位点(Fujita等人，2018年）.此外，藤井实验室产生了转基因小鼠系和逆转录病毒表达系统使用此方法在活的有机体内研究(Fujita等人，2018年）.

除了这种“细胞内”的方法外，藤井实验室还开发了另一种“细胞内”的方法。在这种方法中，基因工程dna结合分子(如CRISPR复合体)在待分析的细胞中表达。在体外”形式。在这种形式下，由重组dCas9蛋白和合成gRNA组成的CRISPR复合体与染色质碎片或纯化DNA文库一起孵育，用于纯化特定的染色质或DNA片段(Fujita等人，2016年）.3xFLAG-tag融合到dCas9，连同生物素化的gRNA，成功地用于该研究。”在体外”形式。

任何标记系统都可以用dCas9和靶向gRNA分离感兴趣的基因组区域。一个这样的例子徐实验室CRISPR亲和纯化吗原位规管要素(CAPTURE) (Liu et al.， 2017）.该系统利用dCas9融合到质粒上表达的生物素化标签上,允许在活的有机体内生物素酰化通过一个plasmid-based生物素连接酶．生物素化的dCas9与DNA结合后，可通过链霉亲和素高亲和纯化得到。该系统具有高度敏感性和特异性，许实验室可以通过蛋白质组学和染色体构象捕捉(3C)技术在众多基因组位点上识别蛋白质和核酸结合伴侣。除了3xFLAG和生物素标签，标签系统包括Protein A, 1xFLAG, 2xAM和HA已经被报道，以及抗cas9抗体的亲和纯化。这些不同的标签系统和亲和纯化方案为这种方法增加了额外的风味。

利用这项技术，研究人员已经开始在各个生物学领域取得重大发现。2015年，藤井实验室通过结合特定基因组区域的纯化和RNA测序，识别出与端粒相关的非编码RNA (Fujita et al.， 2015）.利用与抗cas9抗体类似的亲和纯化，Li实验室发现了一种microRNA (miR483)，它与生长因子IGF2的启动子结合，开放阅读框以放松印迹(Zhang et al.， 2017）.这上调了IGF2的表达，这是许多人类恶性肿瘤的特征。此外,Tapscott实验室发现了DUX4的调节因子，这是一种转录调节因子，当表达不当时可导致面部肩胛肱肌营养不良症(FSHD)，这种疾病目前尚无治愈方法(坎贝尔等人，2018年）.

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结论

crispr介导的特定基因组区域的纯化是基于通过特定gRNA-dCas9复合物靶向基因组位点的许多工具的另一个例子。当与下一代测序相结合时，这种方法可以从单个实验设置中恢复大量数据。正如我们看到的许多其他CRISPR技术，这种方法也有很大的改进和适应的潜力，可以提供更多的理解DNA结合和基因调节。

有关crispr介导的特定基因组区域的纯化、其他形式的enChIP以及Hodaka Fujii实验室进行的其他研究的更多信息，请参见我们的采访藤井裕久博士．

参考文献

坎贝尔，艾米·E等人。“NuRD和caf1介导的D4Z4沉默是由dux4诱导的MBD3L蛋白调控的。”Elife7 (2018): e31023。PubMedPMID:29533181．公共医学中心PMCID:PMC5849414．

藤田，东芝，和藤井浩高。“利用CRISPR工程dna结合分子介导的染色质免疫沉淀(enChIP)，高效分离特定基因组区域和识别相关蛋白。”生物化学与生物物理研究通讯439.1(2013): 132 - 136。PubMedPMID:23942116．

Fujita, Toshitsugu等。通过工程dna结合分子介导的染色质免疫沉淀(enChIP)鉴定端粒相关分子。科学报告3(2013): 3171。PubMedPMID:24201379．公共医学中心PMCID:PMC3821016．

Fujita, Toshitsugu等。“使用enChIP和RNA测序的结合来识别与端粒相关的非编码RNA。”《公共科学图书馆•综合》10.4 (2015): e0123387。PubMedPMID:25874893．公共医学中心PMCID:PMC4395285．

藤田，俊sugu, yuo Miyuki，藤井Hodaka。“利用重组CRISPR核糖核蛋白，通过体外enCh IP技术高效的序列特异性分离DNA片段和染色质。”基因对细胞21.4(2016): 370 - 377。PubMedPMID:26848818.

Fujita, Toshitsugu等。通过enCh IP‐Seq鉴定基因组区域之间的物理相互作用。基因对细胞22.6(2017): 506 - 520。PubMedPMID:28474362．

藤田，俊sugu, yuo Miyuki，藤井Hodaka。“用于分析细菌基因组功能的enChIP系统。”BMC研究笔记11.1(2018): 387。PubMedPMID:29898790．公共医学中心PMCID:PMC6001023．

Fujita, Toshitsugu等。“转基因小鼠系表达3x FLAG‐dC as9蛋白用于enCh IP分析。”基因对细胞23.4(2018): 318 - 325。PubMedPMID:29480524．

Gilbert, Luke A，等。真核生物中crispr介导的模数rna引导的转录调控细胞154.2(2013): 442 - 451。PubMedPMID:23849981．公共医学中心PMCID:PMC3770145．

星野，明美，藤井浩高。插入染色质免疫沉淀:分离特定基因组区域的方法生物科学与工程学报108.5(2009): 446 - 449。PubMedPMID:19804873．

Jinek, Martin等。适应性细菌免疫中的可编程双rna引导DNA内切酶科学337.6096(2012): 816 - 821。PubMedPMID:22745249．公共医学中心PMCID:PMC6286148．

刘欣，等。“通过生物素化的dCas9原位捕获染色质相互作用。”细胞170.5(2017): 1028 - 1043。PubMedPMID:28841410．

戚磊，等。“将CRISPR重新用作rna引导平台，用于基因表达的序列特异性控制。”细胞152.5(2013): 1173 - 1183。PubMedPMID:23452860．公共医学中心PMCID:PMC3664290．

张益群，等。CRISPR cas9引导的染色质免疫沉淀鉴定miR483是肿瘤中IGF2印迹的表观遗传调节剂。Oncotarget8.21(2017): 34177。PubMedPMID:27486969．公共医学中心PMCID:PMC5470959．

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