限制性内切酶克隆是劳动的马分子克隆；然而，其最大的局限性之一是序列修饰只能在限制性内切酶切位点进行。lambda red系统是一种可用于克隆或基因组工程的替代方法，基于同源重组。它允许直接修改内部的DNA大肠杆菌并且独立于限制站点。lambda-red系统源于lambda-red噬菌体，其作为基因工程工具的用途通常被称为重组工程-同源基因的缩写重组民族介导的遗传工程．它可以用来进行各种各样的修饰:插入和删除可选择和不可选择的序列，点突变或其他小碱基对的变化，以及添加蛋白质标签。它还具有修改的灵活性大肠杆菌染色体，质粒DNA或BAC DNA。
要使用红色重组系统来修改你的目标DNA，你首先电孔一个线性供体DNA底物(要么是dsDNA，要么是ssDNA -见下文)大肠杆菌表达lambda红酶。然后，这些酶催化底物与目标DNA序列的同源重组。这意味着克隆发生了在活的有机体内与限制性内切酶克隆相比，限制性内切酶克隆的基因变化是在试管中发生的。供体DNA底物只需与目标位点具有~50个核苷酸的同源性即可进行重组。
Lambda红色重组工程系统的关键部件
lambda红色重组系统有三个组件(图1):1)Exo, 2) Beta，和3)Gam。这三种都是与dsDNA底物重组所必需的;然而，当用ssDNA底物进行修饰时，只需要Beta。
Gam: Gam阻止内源性RecBCD和SbcCD核酸酶消化引入的线性DNA大肠杆菌．
埃索：Exo是一个5'→3'双链DNA依赖性核酸外切酶。Exo将从5'端开始降解线性双链DNA，并产生2种可能的产物：1）具有单链3'悬挑的部分双链DNA；或2）如果双链DNA足够短，则其整个互补链被降解的单链DNA。
βBeta保护由Exo创建的ssDNA，并促进其在细胞中退火到一个互补的ssDNA靶点。与ssDNA寡聚底物重组只需要表达Beta。
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图1:Lambda红色重组工程系统的组件。有关详细信息，请参阅文本。 |
试验大纲
下面是一个通用的lambda red重组实验的简要概述(图2)。在接下来的章节中，将更详细地解释不同于传统限制性内切酶克隆的关键步骤。
- 底物DNA的设计与生成
- 红色重组基因的表达。
- 底物DNA的电穿孔和细菌的生长。
- 重组克隆的筛选与确认。
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图2：使用Lambda红色重组工程系统用抗生素抗性盒替换感兴趣基因的概述。 |
底物DNA的设计与生成
是使用线性dsDNA还是ssDNA底物取决于实验的目的。dsDNA底物最适合于大于20个核苷酸的插入或缺失，而ssDNA底物最适合于只有几个碱基对的点突变或改变。
双链DNA底物
dsDNA插入可以通过PCR，使用引物将感兴趣的DNA序列扩增，并在其侧面添加与目标插入位点同源的50对碱基对(图2，顶部)。这些引物通常有70个核苷酸长(20个核苷酸与感兴趣的DNA序列退火，50个核苷酸与靶点侧翼区域同源)。dsDNA插入的最佳应用包括:大的插入或删除，包括可选择的DNA片段，例如抗生素耐药基因，以及不可选择的DNA片段，如基因替换和标签．重组体的典型频率是10个阳性克隆中有1个阳性克隆4到105聚居地。
专家提示:使用具有校对能力的高保真Taq聚合酶生成dsDNA重组底物，以避免在PCR过程中引入错误。
单链DNA底物
ssDNA底物可以通过排序合成寡核苷酸或变性短PCR产物来生成。无论哪种方式，底物都应该有70-100个核苷酸长，所需的改变位于序列的中心。由于lambda红色具有更高的重组频率时，滞后链的DNA是目标，它是最好的确定方向的复制通过你的兴趣区域和设计一个互补的滞后链。在实践中，更容易的做法是不确定复制的方向，而是设计以双链为目标的寡聚体。这两种寡聚体中的一种会以更高的效率重组而另一种则会以更高的效率重组而另一种则会以更高的效率重组而另一种则会以更高的效率重组。
ssDNA底物的重组频率在0.1%到1%之间，比dsDNA的重组效率更高。通过设计寡聚体，避免激活甲基定向错配修复(MMR)系统，可以将其提高到25-50%。MMR的工作是纠正DNA复制过程中发生的DNA错配。有两种方法可以避免MMR的激活:1)使用一种关键的MMR蛋白被敲除的细菌菌株或2)专门设计ssDNA寡聚体来避免MMR:
1）大肠杆菌使用灭活MMR：使用大肠杆菌使用非活性MMR肯定是两种选择中比较容易的一种，但是这些细胞容易发生突变，并且它们的基因组会有更多意外的变化。
2） 设计避免MMR激活的单链DNA寡核苷酸：有两种方法可以设计避免MMR激活的寡核苷酸。第一种方法是在编辑站点的6个碱基对处或6个碱基对内引入C/C不匹配。这是一个简单的修复方法，但只能在有限的情况下使用。另一种方法是在摆动密码子的4-5个沉默变化的旁边进行所需的变化，即改变相邻4-5个密码子的第三个碱基对，改变翻译蛋白质的核苷酸序列，但不改变氨基酸序列。这些变化可能是所需变化的5'或3'。
表1：ds-和ss-DNA在重组工程中的应用概述
| 基底 | 最适合的应用 | 复合频率 | 特殊注意事项 |
| 双链DNA | >20核苷酸的插入或缺失 | 十分之一4到105 | 使用高保真度Taq聚合酶生成插入物 |
| ssDNA | 点突变或改变一些核苷酸 | 当避免激活MMR时，0.1-1%或25-50% | 在摆动密码子中引入C/C不匹配或沉默变化，以避免MMR激活 |
Lambda Red重组基因的表达
表达lambda红色重组工程系统有四种方式：1）来自整合缺陷原噬菌体的细菌2）来自质粒，3）来自mini-λ或4）来自lambda红色噬菌体本身（以下将详细讨论每种方式）。控制红色蛋白的表达对于最小化Gam表达的毒性作用和限制红色组成性表达时发生的自发突变至关重要。你使用哪种重组系统取决于你想编辑哪种类型的DNA；然而，BAC DNA可以用下述任何一种方法进行修饰。
具有整合缺陷原噬菌体的菌株
一些大肠杆菌由于整合有缺陷的lambda红色噬菌体，存在稳定表达lambda红色重组基因的菌株。其中一种是DY380，它是从DH10B衍生出来的大肠杆菌拉紧其他几种常用于重组工程的细菌菌株可以在T霍马森等和沙兰等（几在Addgene中也可以发现菌株，但请务必阅读相关论文的特殊用途- *注意*不是所有链接菌株包含Lambda Red系统)。
在其中一些菌株中，表达挂式，贝塔和gam受到内源性噬菌体启动子pL和抑制子CI的紧密调控。出于重组的目的，阻遏基因的温度敏感版本，CI857,使用。这种突变的阻遏物在低温(30-34˚C)下阻止重组基因的表达。将细菌移入42˚C 15分钟后，阻遏物迅速失活，重组基因得以表达。在这之后，降低温度允许抑制因子重新自然并再次抑制挂式，贝塔和gam．使用这种方法表达lambda red的一个主要优点是它不需要抗生素选择来维持重组系统的表达。这种设置也可以用来修改染色体基因。在最初的编辑事件之后，有缺陷的原噬菌体可以从宿主的染色体上移除大肠杆菌第二个红色重组事件。或者，如果修饰的等位基因是可选择的，它可以通过P1转导转移到不同的遗传背景。
质体
从一个质粒允许一个可移动的重组系统，但严格的表达调控是一个成功的实验所必需的。启动子常用于控制Red表达的包括IPTG诱导的lac启动子、阿拉伯糖诱导的pBAD启动子和内源性噬菌体pL启动子。选择也表达与这些启动子相关的抑制子的质粒是一个好主意（lacI、araC、，cI857)以限制Red系统的泄漏表达。使用质粒来表达lambda重组系统最适合于编辑细菌染色体DNA，因为一旦产生重组克隆，重组系统很容易移除。一个简单的方法就是从具有热敏复制源的质粒中表达红色基因。一旦不再需要重组系统，细菌可以通过在42℃下生长来“治愈”。
迷你λ
使用质粒和稳定整合有缺陷的原噬菌体之间的一种杂交是使用迷你λ，一种有缺陷的不可复制的圆形噬菌体DNA片段，当引入细菌时，它会整合到基因组中。Mini-λ使用内源性红色启动子pL和cI857调控表达的抑制因子。抗生素可以用来选择阳性克隆，但由于mini-λ稳定集成，药物选择不需要维持。当温度升高至42˚C时，不仅可以激活重组所需的红色基因，而且还可以促进基因的表达int和xis负责从宿主染色体上切除mini-λ的基因。在此之后，mini-λ可以像质粒一样从细菌中很容易纯化。
噬菌体
表达红色系统的最后一个选择是使用lambda红色噬菌体，λ泰特，那个携带四环素抗性基因和红色阻遏因子cI857. 一旦引入，原噬菌体是稳定的，不再需要药物选择。这种方法的一个缺点是需要产生噬菌体，这不是一种常见的分子生物学技术。然而，这种方法的一个优点是，你可以稳定地将红色系统整合到你自己感兴趣的菌株中，如果需要，可以使用P1转导将修饰转移到不同的背景中。这种方法最适合修饰质粒或BAC，因为它能使噬菌体稳定地整合到细胞中大肠杆菌基因组
重组克隆的筛选与确认
如果插入了抗生素耐药基因，可以首先通过抗生素耐药选择重组体，但所有克隆都应进一步测试，以确定所希望的修饰存在。菌落PCR在大多数情况下可用于筛选阳性克隆，限制性内切酶消化可用于筛选适当突变的质粒。点突变和其他细微的变化应由测序，这也是对所有克隆的最好的最终确认，不管什么类型的DNA是被修改的目标:大肠杆菌染色体、质粒或BAC。
专业技巧：单链DNA底物的重组率比双链DNA底物高得多，因此使用双链DNA时应筛选更多克隆。
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非常感谢我们的客座博主贝丝·肯克尔
贝丝·肯克尔(Beth Kenkel)目前是华盛顿大学实验室医学系的一名研究科学家。她对科学传播和体外诊断特别感兴趣。
工具书类
1.科斯坦蒂诺，法院律师。错配修复突变体中λ红色介导的重组子水平的提高。美国国家科学院学报．2003.doi: 10.1073 / pnas.2434959100。PubMedPMID: 14673109．公共医学中心PMCID: PMC307639．
2.俞黛冠、希拉里·M·埃利斯、李易强、南希·A·詹金斯、尼尔·G·科普兰和唐纳德·L·考特。大肠杆菌染色体工程的高效重组系统。PNAS 2000 97（11）5978-5983；2000年5月16日，内政部：10.1073/pnas.100127597。PubMedPMID:10811905公共医疗中心PMCID:PMC18544．
3.墨菲，K.2016。λ重组和重组工程，EcoSal Plus 2016。内政部：10.1128/ecosalplus。PubMedPMID: 27223821．
4.夏朗SK，托马森LC，库兹涅佐夫SG，法院DL。重组:一种基于同源重组的基因工程方法。自然的协议. 2009;4(2):206-223. 内政部：10.1038/nprot.2008.227。PubMedPMID: 19180090．公共医学中心PMCID: PMC2790811．
5.Thomason，L.C.，Sawitzke，J.A.，Li，X.，Costantino，N.和Court，D.L.2014。重组工程：利用同源重组对细菌进行基因工程。分子生物学的最新协议。106:V:1.16:1.16.1–1.16.39。PubMedPMID: 24733238．
6.国家癌症研究所Recombineering页面．
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