很明显，CRISPR-Cas9技术真的改变了任何想要快速、容易地操纵特定基因的人的游戏。但如果你想研究整个基因组的基因呢?两个新人类慢病毒CRISPR库y系统在同行论文中描述科学类去年12月，我们开发了一种新的方法来回答这个问题自然生物技术文章描述了小鼠慢病毒CRISPR文库的开发。
博德研究所的奥菲尔·沙莱姆说：“这使你能够以以前不可能的规模进行定制的基因改造。以前无法获得的整个基因组区域现在都可以通过这项技术获得。”
GeCKO基因组筛选库
同样来自博德研究所的内维尔·桑贾纳（Neville Sanjana）利用慢病毒作为运载工具，说他们能够在几天的时间内在实验室培养皿中产生非常多样化的细胞群壁虎，针对18080个人类基因，具有64,751个独特的引导序列，以实现阴性和阳性选择筛选。
他们和包括冯章在内的同事使用壁虎文库用于识别基因对于癌症和多能干细胞的细胞活力至关重要。在一个黑色素瘤模型中，他们还研究了与癌症药物vemurafenib耐药有关的基因。
选择基因组的丰富文库
可用的6个元素都得到了丰富慢病毒CRISPR库由麻省理工学院的Tim Wang和他的同事(包括David Sabatini和Eric Lander)开发，由73,171个引导rna (gRNAs)组成，涵盖了7114个人类基因。与GeCKO文库不同，每个文库都针对不同的基因靶标进行了富集。这些集合库包括对激酶、细胞周期蛋白等的富集。
“过去，CRISPR基因工程仅限于一次修改几个基因座，”王说。“以混合方式筛选或一次跟踪数千个目标是非常困难的。这是我们的质粒所允许的。”
王的该文库旨在针对一组较小的基因每个基因包含更多的指导。Sabatini/Lander文库使用顺序感染，首先是Cas9，然后是sgrna，由于质粒体积较小，可以导致更高的滴度。另一方面，Zhang实验室使用1质粒，单次感染系统。
全基因组小鼠CRISPR文库
“通过这项工作，现在有可能在哺乳动物细胞中进行系统的基因筛查，”大卫·萨巴蒂尼，该研究报告的资深作者之一科学类报纸，告诉记者博德学院. “这将大大有助于理解蛋白质编码基因和非编码基因的功能。”
这些慢病毒库及其应用证明，CRISPR-Cas9可以用于靶向基因组中的任何序列。
提示和技巧
Wang提供了这个提示：“在这个过程的每一个步骤中，不丢失库表示是非常重要的。”同样重要的是，你要感染足够多的靶细胞。
什么是“足够”取决于你的实验和选择方法。Shalem和Sanjana说，他们在细胞内保留了很高的库代表性，目标是每个结构有300个细胞，但在某些生物系统中，“可能需要更多的细胞。”
更多详细信息和协议可在线访问AddgeneCRISPR图书馆参考页.
引用:
使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中进行基因筛选。王婷，魏俊杰，萨巴蒂尼DM，兰德ES。科学。2013年12月12日。(PubMed).
人类细胞基因组规模CRISPR-Cas9基因敲除筛选。Shalem O，Sanjana NE，Hartenian E，Shi X，Scott DA，Mikkelson T，Heckl D，Ebert BL，Root DE，Doench JG，Zhang F.Science.2013年12月12日(PubMed).
利用慢病毒CRISPR导向RNA文库在哺乳动物细胞中进行全基因组隐性遗传筛查。小池优莎H，李Y，谭E-P，德尔卡斯蒂略·维拉斯科·埃雷拉M，优莎K.自然生物技术。2013年12月23日。(文章).
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