自从发现绿色荧光蛋白50多年前，越来越多的金宝搏app下载荧光蛋白(FPs)一直是研究细胞系统的组织和功能的宝贵资源。FPs已经被用于跟踪蛋白质定位、细胞结构、细胞内运输和蛋白质周转率。此外，通过与细胞器相关的FP融合工程，科学家已经能够研究许多细胞过程，包括有丝分裂、线粒体裂变/融合、核导入和神经元运输。尽管FPs能够发现许多细胞机制，但使用FPs仍然存在一些局限性。荧光标记蛋白的过度表达可能导致蛋白质定位不当、蛋白质聚集或正常蛋白质功能的破坏，最终导致对蛋白质细胞作用的误解。
避免过表达荧光蛋白融合缺陷的一种方法是用荧光蛋白融合替换你感兴趣的基因的基因组拷贝。CRISPR基因组编辑可以帮助实现这一目标。这个系统的力量在于内切酶Cas9在引导RNA (gRNA)序列指定的基因组位点上产生DNA双链断裂(DSB)的能力。用户可以设计grna来诱导特定基因组位点的断裂，并利用内源性同源定向修复途径，在DSB上插入一个新的用户定义的DNA序列(如GFP)。CRISPR使科学家能够标记和点亮感兴趣的内源性基因，以更好地了解正常蛋白质功能。然而，CRISPR蛋白标记也有其局限性，尤其是在尝试进行高通量实验时。如果用户想进行高通量基因筛选，单独生成包含每个插入标签的grna和同源臂修复模板是昂贵和耗时的。此外，筛查含有新标记基因的转基因菌株仍然具有挑战性。大多数插入只能通过PCR等劳动密集型过程或评估视觉表型来检测。
改善秀丽隐杆线虫用SapTrap标记荧光蛋白
的约根森实验室最近开发了一种名为SapTrap来改进CRISPR基因组标记秀丽隐杆线虫．SapTrap为科学家提供了一种方便的单管组装反应生成高通量的目标向量。这些向量可以用来标记内源基因，同时引入选择标记筛选改良菌株。使用SapTrap，用户首先为所需的gRNA目标序列设计寡聚体或合成DNA，以及5 '和3 '同源臂修复模板(图1，步骤1）.无需PCR或克隆，用SapI酶切目的载体得到2个位点，第一个位点接受用于U6启动子表达的sgRNA靶序列，第二个位点接受同源臂修复模板。
SapTrap包括一个预构建的供体质粒库，其中包含几种类型的荧光(EGFP, tagRFP, mCherry)和非荧光(Halo, SNAP)标记，可选择标记(液氧cbr - unc - 119)，便于筛选插入事件，以及各种连接器模块(标签和同源臂之间的连接器序列)。用SapI酶切供体质粒，可以释放标签、可选择的标记和连接器(图1，步骤2-3）.由于相同类型的供体质粒会产生相同独特的SapI 5 '悬吊物，因此从文库中提取的连接器和标签供体质粒的不同组合可以用来生成功能独特的修复模板。最终的连接反应正确地组装最终的靶向载体(图1，步骤4)，将靶向载体与Cas9表达质粒共注射，即可将所需的基因标签和标记序列插入到目标位点。可选择的标记可以通过Cre-mediated切除无疤痕标签插入。
除了SapTrap在单个基因位点的标记方面具有明显的优势外，该工具包还提供了以组织特异性方式标记蛋白质的修复模板，以及在多个靶位点插入标记的3位点目标载体。SapTrap载体可以很容易地修饰以标记数百个基因，产生强大的基因筛选库。
附加蛋白质标记系统
为那些不工作的人秀丽隐杆线虫在美国，有几个研究小组设计了模块化工具包，以协助在其他模型系统(包括哺乳动物细胞)中标记基因组位点。
- CRISPaint (CRISPR-assisted insertion tagging, CRISPR-assisted insertion tagging)，是由美国霍农实验室，用户可以轻松创建人体细胞内内源性基因的c端标签融合。使用CRISPaint需要3个载体:1)以感兴趣的基因为靶点的gRNA载体，2)指定插入的阅读框的质粒，3)包含所需标签的载体，可以获得作为通用供体质粒的载体。的CRISPaint工具包包括几个供蛋白标记质粒，包括荧光素酶(NanoLuc)，荧光蛋白(TagGFP2, TagBFP, TagRFP, T2A-TurboGFP-PEST)和小表位标签(HA金宝搏app下载, Myc, Strep tag II, AviTag, HaloTag, SpyTag)。
- 的Foerstemann实验室开发了一种基于聚合酶链反应(PCR)的系统，该系统允许用户生成一个包含所需gRNA与U6启动子直接融合的质粒，以及一个包含同源臂和N-或c -末端标签的第二个质粒。然后将这两个PCR反应混合，并与Cas9表达载体一起转染。它们也可以直接引入果蝇S2细胞系稳定表达Cas9。该PCR工具包提供了C端和n端标记载体(如GFP, Flag, YFP, Strep, TEV-V5)，可以选择芽胞霉素或嘌呤霉素。
- 艾伦细胞科学研究所的研究人员最近开发了一种质粒的集合用于哺乳动物细胞中细胞结构的荧光标记。在CRISPR/Cas9诱导断裂后，这金宝搏app下载些质粒使用与感兴趣基因长区域同源的荧光蛋白来促进同源性直接修复。了解更多关于这些结构和它们在艾伦研究所用来创建的细胞系的信息最近的博客文章．
- 更多关于用于内源性蛋白质标记的其他CRISPR/Cas系统的信息，请访问我们的网站CRISPR/Cas质粒-蛋白质标记．
除了简单地监测蛋白质的定位和活性外，CRISPR标记系统还可以被修改来分析额外的蛋白质特征。例如,Masato Kanemaki的该实验室开发了一种基于CRISPR/ cas的系统，用于用生长素诱导降解(AID)标签标记内源性蛋白质，以生成可降解的蛋白质快速、可逆在培养基中加入生长素后降解。任何数量的调控序列，包括蛋白质增强子和抑制子，都可以包含在修复模板中，以诱导改变蛋白质表达水平。
CRISPR标记系统为研究蛋白质表达、定位和蛋白质相互作用提供了一种简单有效的方法来标记内源性蛋白质。此外，多亏了像SapTrap这样的标记系统中包含的载体的模块化排列，科学家们将能够生成包含内源性位点荧光标记蛋白的全基因组文库，从而揭示之前未知的蛋白质功能。
参考文献
马修·l·施瓦茨和埃里克·m·乔根森。SapTrap，一个用于秀丽隐杆线虫高通量CRISPR/Cas9基因修饰的工具包。遗传学。202(4)(2016):1277 - 88。PubMedPMID: 26837755．公共医学中心PMCID: PMC4905529．
Schmid-Burgk, Jonathan L.等，“CRISPaint允许使用连接酶4依赖的机制进行模块化碱基特异性基因标记。”Nat Commun. 7(2016):12338。PubMedPMID: 27465542．公共医学中心PMCID: PMC4974478．
夏sume, Toyoaki，等，“利用短同源供体的生长素诱导的Degron标记快速消耗人类细胞中的蛋白质”。细胞Rep.15(1)(2016): 210 - 8。PubMedPMID: 27052166．
Kunzelmann, Stefan等人，“果蝇黑腹细胞基因组编辑的综合工具箱”。G3 (Bethesda) 6(6)(2016):1777-85。PubMedPMID: 27172193．公共医学中心PMCID: PMC4889673．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
在Addgene.org上的资源
- 检查SapTrap设备页面
- 寻找其他的荧光蛋白包
- 浏览荧光蛋白集合
留下你的评论