似乎每周都有新的CRISPR进展或技术发表!最新的应用之一是使用荧光标记Cas9标记活细胞中的多个基因组位点的彩色系统。而其他系统可以用来标记基因座，如荧光原位杂交(FISH)或荧光标记的TALEs，CRISPR / Cas9易于使用和标记活细胞的能力使这个系统真正的优势。这种新技术是在Thoru Pederson的实验室，使我们更接近于绘制4D核组，即细胞核在空间和时间上的组织，并了解细胞核组织在细胞生命周期中如何变化，或组织在疾病状态下如何改变。
dCas9得到了一个彩色的改造
即使没有核酸酶活性，催化死Cas9 (dCas9)有许多应用，最著名的是转录激活/抑制。dCas9以前也被采用过荧光标记一个与其gRNA相匹配的序列，有助于对特定位点染色质动态的实时研究。该系统的一个局限性是单色标签;多色标记可以使多个基因座可视化。这样的系统可以用来检查染色体间和染色体内的动力学，以及它们是如何对细胞周期或其他刺激做出反应的。
要创建一个彩色的Cas9工具箱，马等。转而研究SpCas9及其同源基因NmCas9和St1Cas9。每一种同源物都被融合到不同的荧光蛋白中，形成三种颜色。这些直方图的特异性是关键:由于PAM序列为一个dCas9设计的gRNA应该是特定于该直系亲属的，而不是与其他直系亲属相互干扰。
Ma等人使用特定于端粒序列的gRNAs检测了他们的dCas9变异，发现不同荧光标记的dCas9亚型可以有效地指向合适的目标序列。他们还能够使用特定于9号和13号染色体序列的grna来标记两对不同的染色体。
接下来，他们将注意力转向绘制染色体内基因座对。该技术成功地解析了物理地图距离为75和2 Mbp的位点，计算出的荧光距离与之前建立的物理地图相关。在比较两对靶蛋白~2 Mbp之间的差异时，他们注意到即使在这么小的距离内，他们也可以评估染色质的压实程度!据作者所知，这项工作代表了首次绘制染色体内位点，是表征4D核组的主要基准。
未来的修改和应用
Ma等人使用标准荧光显微镜开发了这项技术，因此受到其低分辨率的限制。这种方法与超分辨率显微镜的结合可能会提高分辨率，尽管背景信号将是一个问题。这项研究的另一个警告是该方法的敏感性。作者估计至少150-200个荧光蛋白分子是检测信号所必需的，这限制了该技术的灵敏度。一个可能的解决方案是SunTag，一种合成支架，可用于招募多种蛋白质分子(也可从Addgene!)由于SunTag提供的信号电平很高，细胞可以在较低的照明设置下进行成像，从而降低了光漂白和光毒性问题，延长了该技术潜在的成像时间。
美国国立卫生研究院共同基金已经取得了绘制4D核组这是一个特殊的优先事项，因为研究人员的工作是增加我们对染色质组织的理解。这种基于CRISPR/ cas9的荧光方法是基因组位点活细胞成像的一大进步。Ma等人预计该技术将适用于细胞周期进展、表观遗传学和细胞对外界刺激的反应的研究。它还可以在癌症方面有重要应用，例如，可视化染色体易位或染色体碎裂(色蓟病)。随着这项研究的加入有用的CRISPR / Cas9技术在Addgene，我们很兴奋地看到下一个!
参考文献
人类细胞中染色体位点的多色CRISPR标记。Ma H, Naseri A, reys - gutierrez P, Wolfe SA, Zhang S, Pederson T. proceedings of Natl academy Sci . 2015 3月10日;112(10):3002-7。doi: 10.1073 / pnas.1420024112。2015年2月23日。Pubmed．
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利用优化的CRISPR/Cas系统对活体细胞基因组位点进行动态成像Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91。doi: 10.1016 / j.cell.2013.12.001。Pubmed．
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用于基因表达和荧光成像信号放大的蛋白标记系统。[j] . acta photonica sinica, 2014, 39 (3):635- 643 .]doi: 10.1016 / j.cell.2014.09.039。2014年10月9日Pubmed．
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