在复杂的后生动物中，快速细胞分裂和大规模细胞移动是胚胎发育过程中的基本过程。这是生长中的生物体从一团细胞向完全分化的机体进行复杂过渡所必需的。相比之下，这些动态过程在成体生物体中基本上不存在，在成体生物体中，组织结构更稳定，局部运动占主导地位（例如，一个基底祖细胞迁移到上皮细胞）。在这个阶段，只有来自上皮细胞的细胞免疫系统通过从骨髓和其他淋巴器官到特定组织的运动，显示出广泛的活动性，在那里他们可以扫描任何危险的迹象。在这篇文章中，我们将重点介绍如何金宝搏app下载可以并且已经被用来监测免疫系统中的细胞运动。这里使用的技术可以适用于研究其他系统，在这些系统中，生物体中有大规模的细胞运动。
研究这些复杂环境中的细胞流动性从来都不是一件容易的事，而且多年来，研究人员缺乏直接跟踪淋巴器官中的免疫细胞的良好工具。细胞分类器的发展和荧光标记抗体的工程使追踪细胞从一个器官到另一个器官成为可能。因此，几个实验室能够破译淋巴细胞从骨髓到胸腺的过程，并在胸腺中获得特异性，或者从胸腺到淋巴结。与过去化学染色淋巴器官的静态显微镜图像相比，这些方法为研究人员提供了更多关于免疫细胞流动性的信息。
研究人员如何追踪荧光标记的细胞?
1.荧光显微镜
这项技术使用荧光显微镜，光源安装在样本上方（epi），激发光通过显微镜物镜朝向样本。它允许显示样本中表达的荧光蛋白。金宝搏app下载
2.荧光活化细胞分选机(FACs)
这是一台根据细胞是否被荧光蛋白或其他标记进行分类的机器染料．它在振动喷嘴中机械地将细胞分离在振动喷嘴中，向荧光的细胞赋予阳性或负电荷，然后通过电池通过电场将它们转移到适当的容器中。该机器可用于区分被不同荧光蛋白或染料标记的细胞群。金宝搏app下载
3.双光子显微镜
3.双光子显微镜双光子激发显微镜是一种荧光成像技术，允许在深度上达到约1毫米的活组织。两个低能量光子（通常来自相同的激光）配合在荧光分子中引起更高能量的电子转换（参见右图）。由这些双光子产生的激发仅发生在所选择的焦卷体中，因此显微镜仅捕获来自该体积的荧光。结果是您可以检测厚标本中的信号。从PLOS病原体中看到下面的视频，从PLOS病原体中查看两光膜滚动显微镜Kamenyeva等人，2015年．
荧光蛋白支持的细胞运输研究金宝搏app下载
GFP及其衍生物的后期优化钱永健改变了一切。首次，荧光蛋白给研究人员能够在器官内跟踪金宝搏app下载免疫细胞并想象细胞在特定刺激后的相互作用。使用ePiforEcence显微镜和绿色荧光蛋白融合蛋白由免疫系特异性启动子控制，科学家可以很容易地追踪到表达GFP的细胞。例如，通过在抗原激发后的不同时间收集淋巴结，科学家们能够追踪GFP标记的B细胞在这些器官的固定切片中的位置。这些有GFP标记的细胞也可以被细胞分类器追踪，使免疫学家能够计数细胞并统计分析细胞运动。通过使用由荧光化学物质或其他荧光蛋白标记的细胞，实验室还能够看到几种不同免疫细胞之间的运动和相互作用。金宝搏app下载这些方法使免疫学家能够建立免疫反应的时空视图，但这些动态的研究仍然是费力的，因为表面荧光显微镜无法实时给出细胞运动的清晰视图。
双光子显微镜是细胞成像的下一次革命，使研究人员能够实时监测蜂窝运动的能力。本技术首先在2002年期刊中的三篇论文引入免疫学。现在，这种技术和体内活细胞成像（流管高学成像）研究其使能揭示了在不同组织环境中介绍适应性和先天免疫的蜂窝行为。这些研究提供了细胞运动，相互作用和响应动态的定量测量。
在过去15年中，我们努力创造转基因小鼠在免疫谱系中表达荧光蛋白报告结构。通过对T细胞、B细胞和抗原呈递细胞进行特异性标记，科学家已经能够揭示淋巴器官中的细胞动力学。例如，在淋巴结中，双光子显微镜使科学家能够更好地了解适应性免疫系统中的T细胞起始免疫反应。众所周知，T细胞能够从血流中渗出，侵入淋巴结并扫描抗原呈递细胞，但双光子显微镜使科学家们能够看到扫描过程是多么混乱和随机，以及T细胞从一个抗原呈递细胞跳到另一个抗原呈递细胞的速度有多快。事实上，我们现在知道T细胞是一种免疫反应e能够比身体中任何其他类型的细胞爬得更快！
由双光子显微镜驱动的活体内成像揭示了宿主-病原体相互作用，从而有助于理解感染组织中的效应器功能。在使用双光子成像之前，我们对病原体-免疫细胞相互作用的理解依赖于体外难以理解存在的特殊细胞类型和器官的关键作用的研究体内．使用荧光病原体和荧光细胞使科学家能够监测不同组织中的细胞相互作用，包括淋巴结、大脑、肝脏、肠道和皮肤．
双光子呈动脉显微镜。上面的视频描述了表达LysM-GFP（绿色）的中性粒细胞在感染病毒后浸润到引流淋巴结金黄色葡萄球菌（红色的）。然后，你可以看到蜂窝群金黄色葡萄球菌吃细菌。
使用双光子显微镜，科学家们已经能够帮助回答的许多问题包括:
- T细胞和/或中性粒细胞如何到达感染或损伤部位（Peters等人。2008年，Chtanova等人。2008年，Kamenyeva等人2015年）？
- 在免疫反应中，单核细胞如何巡逻血管（Auffray等人，2007年），Finsterbusch等人，2016年)?
- 树突状细胞如何迁移到淋巴结来激活T细胞(Celli等人，2008年，Kitano等人，2016年，卡瓦纳等人，2008年)?
双光子显微镜的技术挑战
活体内成像是一种简单的方法，可以了解在稳态或生理病理挑战下身体内发生的情况。但是，必须考虑技术的特殊性，尤其是在使用荧光蛋白跟踪细胞运动和相互作用时。即使几乎所有荧光蛋白都可以用于在您的实验中，经验表明，一些更可靠、更有效地跟踪细胞。使用标准钛宝石激光器时，良好的双光子探针包括：金宝搏app下载
- 蓝绿色荧光蛋白，如EG金宝搏app下载FP
- 黄橙色荧光蛋白，如TagRF金宝搏app下载P、tdTomato、DsRed、mKate系列或tdKatushka2(Drobizev等人，2011年）
常用的橙色和红色荧光蛋白由750 nm至760 nm的激光激发，使金宝搏app下载蓝色或青色蛋白的双色成像研究无需改变激发波长(Salomonnson等人。2012年）.它们也可以在1,000nm和1,200nm之间有效地振兴，其中组织吸收相对较少，组织散射弱，少量组织自动荧光（Drobizev等人，2011年）.但这需要其他激光器，而不是标准的钛:蓝宝石激光器。精细调整激发波长也很重要，因为研究表明，即使激发波长的微小变化也会显著影响荧光蛋白的发射强度(Salomonnson等，2012)。金宝搏app下载
最后，值得一试荧光蛋白的光稳定性当使用双光子显微镜时，因为这对许多荧光蛋白还没有很好的报道。金宝搏app下载
附加荧光蛋白工具
光活化荧光蛋白金宝搏app下载（在光诱导的化学反应后发泡的蛋白质）或光可逆的Keade蛋白（经历光诱导的来自绿色荧光到红色荧光的蛋白质）也是用膀胱成像使用的有用工具。这些工具允许人们通过在特定时间标记细胞来研究细胞迁移和运动的动力学。例如，可光激活的荧光蛋白已成功金宝搏app下载地用于研究小鼠淋巴结的发芽中心内的B和T细胞动态。但是，在使用光激活的FPS时必须注意时间尺度 - 标记单元格内的劣化限制了可用于跟踪某些单元格类型的时间表。
标记和跟踪单元格的另一个有用工具是Cre /液态氧复合系统．研究人员可以用LOXP位点在质粒中侧翼荧光蛋白金宝搏app下载，使得它们的表达在表达CRE的细胞上打开或关闭。这样的系统的结果是用不同荧光蛋白标记的细胞的马赛克。金宝搏app下载使用此系统的一次迭代调用脑弓，Ubow小鼠品系已经建立，分别在皮肤和淋巴结内定位朗格汉斯细胞和滤泡树突状细胞。与光活化或光转化蛋白质相比，使用cre-lox对细胞进行永久性标记是有利的，因为它能够在细胞的整个生命周期中进行跟踪。
在过去的15年中，围绕着荧光蛋白和活体成像的使用，人们已经看到了许多进展，以了解免疫细胞在触发免疫反应中的关键作用。新的荧光蛋白可以在双光子显微金宝搏app下载镜中更有效地使用，新的结构有助于创建可用于命运定位实验的小鼠系。由于这些技术，人们对免疫反应动力学有了更好的了解，但仍存在许多问题。其他技术的使用，例如Optimetics.和CRISPR / Cas9将帮助免疫学家创造更好的工具和模型，以进一步我们对免疫系统及其动力学的理解。
工具书类
1.体内成像揭示了中性粒细胞在沙蝇传播的利什曼病中的重要作用科学类321.5891（2008）：970-974.PubMedPMID:18703742. PubMedCentralPMCID:pmc606057．
2.感染期间淋巴结中性粒细胞迁移的动力学免疫力29.3（2008）：487-496.PubMedPMID：18718768. PubMedCentralPMCID:PMC2569002．
3.埃文，杰克逊G.等人。“巨噬细胞和T细胞动态在分枝杆菌肉芽糖颗粒的发育和崩解期间。”免疫力28.2（2008）：271-284。PubMedPMID:18261937. PubMedCentralPMCID：PMC2390753．
4.活体成像显示分枝杆菌肉芽肿中抗原呈递和T细胞效应器功能有限免疫力34.5 (2011): 807-819. PubMedPMID：21596592.. PubMedCentralPMCID:PMC3164316．
5.基帕，马塞洛等。“由于上皮细胞TLR的参与树突状细胞向小肠延伸的动态成像。”实验医学杂志203.13（2006）：2841-2852.PubMedPMID:17145958. PubMedCentralPMCID: PMC2118178．
6。Schaeffer，Marie等人。“用弓形虫慢性感染的小鼠大脑中T细胞 - 寄生虫相互作用的动态成像。”免疫学杂志182.10（2009）：6379-6393。PubMedPMID：19414791.．
7。约翰，比娜等人。“刚地弓形虫感染期间CD8+ T细胞和树突状细胞的动态成像。”巴解组织病理学5.7（2009）：e1000505.PubMedPMID: 19578440. PubMedCentralPMCID：PMC2700268．
8。等。“在淋巴结的外周滤泡间区直接启动抗病毒CD8+ T细胞。”自然免疫学9.2（2008）：155-165.公共医学PMID: 18193049．
9。利什曼原虫主要感染部位CD4 T细胞抗原识别的动态图谱细胞宿主和微生物6.1（2009）：23-33。PubMedPMID：19616763．
10Drobizhev，Mikhail等。“荧光蛋白的双光子吸收性能。”金宝搏app下载自然方法8.5（2011）：393-399.PubMedPMID:21527931. PubMedCentralPMCID：PMC4772972．
11.多光子显微镜荧光蛋白的细胞和活体光谱分析金宝搏app下载生物医学光学杂志17.9(2012): 0960011 - 0960011。PubMedPMID:22975677. PubMedCentralPMCID：PMC3438408.．
12.中性粒细胞向淋巴结的募集限制了局部对金黄色葡萄球菌的体液反应巴解组织病理学11.4（2015）：e1004827.PubMedPMID：25884622. PubMedCentralPMCID: PMC4401519．
13.auffray，cedric等人。“通过巡逻行为的单核细胞群体监测血管和组织。”科学类317.5838（2007）：666-670.PubMedPMID: 17673663．
14.在急性炎症肾小球中，巡逻单核细胞促进血管内中性粒细胞活化和肾小球损伤美国国家科学院院刊(2016): 201606253。PubMedPMID：27528685. PubMedPMCID:PMC5024581．
15塞莉、苏珊娜、贝特里斯·布雷特和菲利普·布索。“淋巴结中自然杀伤细胞和树突状细胞的活体双光子成像。”先天免疫（2008年）：119-126。PubMedPMID: 18370151．
16。Kitano，Masahiro，等。“皮肤排水淋巴结中交叉呈现树突细胞亚群的成像。”美国国家科学院院刊113.4(2016): 1044 - 1049。PubMed采购经理人指数：26755602. PubMedCentralPMCID:PMC4743831．
17。露易丝·L·卡瓦纳和沃尔夫冈·文宁格。“树突细胞在体内的行为:来自活体双光子显微镜的经验。”免疫学和细胞生物学86.5（2008）：428-438。PubMedPMID:18431356．
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