金宝搏app下载荧光蛋白101:荧光蛋白定时器

当FP定时器第一次被表达时，它们主要发出一种颜色的荧光，但慢慢成熟，直到它们主要发出第二种颜色的荧光。这种变化通常被假设为是发色团氧化的结果。一些比较流行的定时器(无论是作为蛋白质融合的一部分还是独立表达的)最初发出绿色或蓝色的荧光，当它们成熟时，发出红色的荧光。在一个计时器种群中，成熟颜色(红色)与不成熟颜色(绿色或蓝色)的比率表明池的年龄:比率越高，池的年龄越大。

计划生育计时器大约从2000年开始Terskikh et al。报告生产安全域E5．这个计时器可预见地从绿色荧光过渡到红色荧光(500到580 nm)在18小时的过程中在体外(参见Terskikh等人的图1B)，甚至显示了14小时表达的可预测动力学秀丽隐杆线虫胚胎。然而，这个初始定时器是四聚体总倾向在细胞(Tsuboi et al。)，限制其使用。尽管如此，它的创建者注意到一些特性现在已经成为理想的FP定时器的标志:

1.表达时间的比率测定

FP定时器显示的成熟荧光与未成熟荧光的比率为取决于总表达式时间但与蛋白质浓度无关．因此，将这个比率与总表达时间相关联的校准曲线可以用来确定FP计时器池表达了多长时间，无论是在整个细胞中，还是作为定位于细胞特定区域的融合蛋白池。例如，如果红色/绿色荧光的比率在理论计时器的线性窗口内，如图1B所示，您可以使用适合于该线性区域的方程来求解总表达式时间。

2.定时器功能与单一基因

尽管我们可以制作一个由两种独立FPs组成的计时器系统(一种成熟较快，另一种成熟较慢)Verkhusha et al。)，常见FP定时器的一个好处是，您可以通过表达单个FP定时器蛋白或蛋白融合来监测年龄。这一蛋白质方法简化了克隆，使您的实验设置不那么繁琐。

3.跨多个系统的可移植性

Terskikh et al。显示他们的多功能计时器可以使用在体外，在哺乳动物细胞中秀丽隐杆线虫,在非洲爪蟾蜍胚胎。当然，计时器可能对氧气、温度和pH值的变化很敏感，但计时器的活动可以根据这些不同的条件进行校准，从而使在许多实验设置中使用给定的计时器。

单体荧光蛋白定时器

自从2000年生产出最初的FP定时器以来，研究人员已经意识到四聚荧光蛋白有多么容易聚集。金宝搏app下载细胞毒性、定位不当和功能下降都是FP聚集的可能结果，如Erik Snapp的博客文章所示。为了避免这些问题，Subach et al。和Tsuboi et al。开发了聚合倾向较小的单体FP定时器。

这些单体FP定时器(来自Tsuboi等人的mK-GO和英国《金融时报》系列来源于Subach等)，分别来源于之前开发的单体荧光蛋白mKO和mCherry。金宝搏app下载虽然Tsuboi等人在试图通过其他方式增强mKO时偶然地开发了mK-GO，但Subach等人利用蛋白质结构和饱和突变的知识共同努力开发了他们的FT系列。mK-GO从绿色成熟到红色，FT系列从蓝色成熟到红色(发射光谱和吸收光谱见表1)。Subach等人的定向诱变也产生了表中所示的三个单独的定时器:Fast-FT、Medium-FT和Slow-FT。这些蛋白显示出逐渐延长的蓝色荧光成熟时间和不同的蓝-红成熟时间(表1)。这些单独的蛋白应该有助于监测发生在不同时间尺度的细胞事件。

表1: Subach等的单体FP定时器和相关质粒。

荧光蛋白定时器的应用

FP计时器已经被用于:

• 通过将各种囊泡货物与FP定时器mk-GO融合，监测囊泡融合和从质膜释放的动力学(Tsuboi等)。
• 通过控制FP定时器DsRed-E5监测发育中的胰腺基因表达Neurog3(控制胰腺分化的基因)Miyatsuka et al。）
• 通过融合Medium-FT和LAMP-2A(一种溶酶体相关的膜蛋白)，并跟随其亚细胞定位，区分运输到溶酶体的模型(Subach等)。
• 在合成电路中监测蛋白质表达动态(Saxena等．）

一般来说，FP定时器可以用于任何情况下，当一个人想要了解细胞、蛋白质或细胞结构的年龄和一个特定的生物事件(贩运到亚细胞位置，基因表达的开始，细胞结构的发展，等等)之间的关系。因此，FP定时器应该在动物发育的研究中发挥作用，比如新生组织的模式和四肢的形成与基因表达的变化相关。例如，在一个发育中的胚胎中，研究人员可以确定当新的身体部分形成时，新合成的或长寿的转录因子是否控制基因表达的总体变化。在合成生物学中，FP定时器可能能够告诉研究人员是新细胞还是老细胞更擅长生产化合物，从而使他们优化化合物生产过程。

你是如何使用FP定时器的?你是否计划以一种新的、有创意的方式使用FP计时器?请在下面的评论区告诉我们!

参考文献

1.Terskikh, Alexey等。"荧光计时器":随时间改变颜色的蛋白质。"科学290.5496(2000): 1585 - 1588。PubMedPMID: 11090358．

2.Tsuboi, Takashi等。新开发的单体荧光定时器蛋白揭示的神经内分泌细胞中年龄依赖性优先致密核囊泡的胞吐细胞的分子生物学21.1(2010): 87 - 94。PubMedPMID: 19889833．公共医学中心PMCID: PMC2801723．

3.Verkhusha, Vladislav V.等。红色荧光蛋白DsRed的增强突变体，用于神经纤维束形成的双重标记和发育计时器生物化学杂志276.32(2001): 29621 - 29624。PubMedPMID: 11408473．

4.等。"单体荧光计时器从蓝色变为红色报告了细胞贩运"化学生物学性质5.2(2009): 118 - 126。PubMedPMID: 19136976．

5.Miyatsuka, Takeshi, Zhongmei Li, Michael S. German。颞叶细胞标记显示胰岛分化的年代学糖尿病58.8(2009): 1863 - 1868。PubMedPMID: 19478145．公共医学中心PMCID: PMC2712795．

6.Pratik等。“一种可编程的合成谱系控制网络，将人类ips细胞区分为葡萄糖敏感的胰岛素分泌样细胞。”自然通讯7(2016)。PubMedPMID: 27063289．公共医学中心PMCID: PMC4831023．

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