在我们的鼠标建模博客系列的第1部分在美国，我们介绍了可用于将基因修饰引入小鼠胚胎的技术。但是，一旦你产生了一个不断增长的基因工程小鼠群体，你能做什么呢?在这篇文章中，我们将介绍为什么以及如何通过杂交小鼠来创建双敲除系和creo -lox系，以及如何在你的实验中适当地控制转基因小鼠。
正如您在第1部分中了解到的，有许多类型的基因工程小鼠:转基因小鼠、敲除和敲除小鼠、条件敲除或敲除小鼠。虽然这些技术都是有用的引入一个修改到小鼠基因组，但它们通常不用于引入多个突变。这是因为随着更多的突变被引入到单个胚胎中，老鼠最终在每个等位基因上都具有预期基因型的可能性降低了。
杂交小鼠以产生所需的表型
相反,基因工程应该分别将每个突变导入不同的小鼠，然后将这些菌株杂交产生双突变后代。杂交小鼠可以产生后代，这些后代的每一个父母都有基因突变的组合。以下是如何杂交小鼠，使用一个简单的例子，目标是生成基因组中有两个修饰基因的小鼠，并假设孟德尔遗传模式：
1.对你的亲代小鼠进行基因型
为了确保你的基因改造将遗传给F1代的所有后代，你的育种计划应该从亲代老鼠开始，每个亲代老鼠都是纯合的，你希望在你的后代中结合两种突变之一。基因分型包括从每只老鼠身上取一小块组织(通常通过抽血、尾巴夹或脚趾夹)并使用聚合酶链反应用合适的引物来检测你的目标载体或感兴趣的基因。
2.培育你的亲代小鼠，使其达到F1
一旦你完成了第一次交叉，恭喜你!你已经产生了F1小鼠，它们是你想要的突变组合产生小鼠的下一个步骤。假设你的亲代小鼠与你感兴趣的基因都是纯合的，你的F1小鼠将携带这些等位基因。
一些等位基因，如Cre，在半合子时发挥作用，这意味着只有一条染色体包含转基因，才能看到效果。半合子小鼠可以包括在与杂合子小鼠相同的育种策略中。在这种情况下，你的亲代老鼠在合适的等位基因上应该是半合子的。当与具有不同突变的纯合子的小鼠杂交时，F1后代要么是半合子的，要么是一个位点(例如Cre)的缺失，而在另一个位点是杂合子的。
3.培育你的F1一代
现在，你的目标是培育出所有你想要的基因都是纯合子的老鼠。还记得高中生物课上的庞尼特方格吗?它们在这里会派上用场的!杂交你的F1杂合子将产生大约1 / 16的小鼠携带纯合子等位基因在你的两个基因的兴趣。大约每4只老鼠中就有1只会在其中一个等位基因上发生纯合突变，而不是在两个等位基因上都发生突变。你可以杂交纯合或杂合的小鼠从你的F1代继续建立你的菌落。你应该对你所有的F1小鼠以及后代的后代进行基因分型。
4.继续繁殖你的菌落
你需要在所有你想要的等位基因上产生足够的纯合(或半合)小鼠来进行你的实验。在整个过程中，你也应该保持你的亲代血统。
在F1代和后代中，带有一个或两个等位基因的纯合子野生型小鼠，或杂合子小鼠，都不是浪费。最好的做法是在你的实验中使用一窝老鼠对照——使用在你的种群中繁殖的老鼠，而不是从饲养中心订购对照组老鼠。这是一个更好的对照，因为实验小鼠和对照小鼠都是在相同的环境中饲养的，并且会有类似的表观遗传修饰。
特殊的繁殖情况下
无论你的小鼠群体是由单一突变的基因工程小鼠还是经过杂交的菌株组成，都有许多考虑有效地培育你的小鼠。因为它们的繁殖涉及到一个新基因随机地整合到它们的基因组中，一些转基因菌株很难繁殖。影响生殖的转基因小鼠的一些问题包括胚胎致死率、短寿命或不育，这些问题可能是由于转基因的复制数量、表达水平和整合位点引起的。这些问题可以用不同的方法来缓解。在对转基因菌株进行工程设计之前，应该在细胞系中测试所使用的启动子，以确定它如何影响转基因的表达水平。在现有的小鼠品系中，可以将转基因维持在半合子或杂合子的背景上，以减少拷贝数或表达水平效应。
另一个可能出现的挑战是，当有多个突变的小鼠杂交时，突变是否在同一染色体上。同源染色体在减数分裂期间重组，产生配子，其中包含来自每一个父母的遗传物质的混合。如果你试图交叉的两个突变都位于亲代的同源染色体上，它们很可能在未来的后代中也会留在单独的染色体上，这个概念叫做连杆．这阻碍了F2代及以后的小鼠对两种突变均为纯合子的可能性。染色体上两个感兴趣的位点之间的距离越短，两个位点之间发生交叉的可能性就越小，这样两个突变就会发生在同一条染色体上。在两个位点发生交叉之前，F2和后代小鼠只能对每个突变的等位基因杂合。
Cre-lox表达菌株
克鲁克斯系是由杂交得来的小鼠的一个常见例子。在第一部分中，我们解释了基因重组是如何在小鼠中表达这两种基因的Cre和LoxP发生。但是这些老鼠一开始是怎么制造出来的呢?制作了creo -lox小鼠通过将表达Cre的菌株与表达感兴趣的卷曲基因的菌株杂交。Cre可以在整个细胞中表达(在小鼠的每个细胞中)，也可以以组织特异性的方式表达(表达由组织特异性启动子控制)。而且，Cre也可以是构成表达的，也可以是诱导表达的(这在本系列的第1部分有更多解释)。在任何情况下，Cre都是显性表型，而你会希望卷曲基因是纯合子的，以便Cre介导的重组能影响实验小鼠中目标基因的每个副本。这将需要几轮繁殖，你会想基因型你老鼠Cre, loxP和你感兴趣的基因的表达。为了确保你在实验中看到的效果是在floxed位点重组的结果，你的对照应该是表达Cre而不是loxP的窝伴侣。
随着这两部分的小鼠建模指南现在完成，你应该准备计划一个实验策略，使用基因工程小鼠。祝你的实验成功!
工具书类
贝彻、伯克哈德、阿里·韦斯曼和卢立凡。小鼠的条件基因靶向:问题和解决方案免疫力48.5(2018): 835 - 836。PubMedPMID:29768166．
Zickler, Denise和Nancy Kleckner。减数分裂期间同源物的重组、配对和突触。冷泉港的生物学观点7.6 (2015): a016626。PubMedPMID: 25986558．公共医学中心PMCID: PMC4448610．
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