随机多色标记技术是神经科学和发育生物学研究的热点。这种类型的细胞标记技术包括引入含有不同颜色荧光蛋白(XFP)的转基因结构来标记一个器官或整个有机体。金宝搏app下载因为每个细胞都可以有多个独立重组的转基因副本，当XFP组合表达时，细胞可能获得多种颜色中的一种。每个细胞在其整个生命周期中保持相同的颜色，子细胞保持相同的颜色，允许细胞种群随时间的命运映射。通过允许细胞在发育过程中持续发光的工具，可以在生物水平上跟踪单细胞动态。随机多色标记系统，许多基于Brainbow，现在存在于各种物种，细胞类型和研究应用。
用Brainbow标记神经元
李奇曼集团开发了这项技术在2007年的最初迭代．用于标记小鼠小脑中的神经元，该团队恰当地命名了他们的技术大脑彩虹．大脑彩虹1.0使用荧光团RFP(红色)，YFP(黄色)和膜系CFP(青色)。Brainbow 1.1增加了OFP(橙色)(Livet et al.， 2007)。
大脑彩虹使用Cre /液态氧系统标记神经元。编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联，但金宝搏app下载只有直接跟随启动子的基因被表达。cre介导的这些基因中的一个或几个的缺失允许在构建中更下游的基因表达。在Brainbow 1.0和1.1中，由于RFP和OFP分别位于启动子的直接下游，细胞会发出红色或橙色的荧光，直到发生重组。
在Brainbow 1.0开发之后，已经开发了几个更精细的版本，它们在系统中使用的荧光蛋白的数量、稳定性和亮度上有所不同。金宝搏app下载
Brainbow 2.0就是这样一个系统，它使用Cre来触发两个头对头排列的基因的反转。另一个变异，Brainbow 2.1，使用Cre来触发两个串联的头对头排列的基因组的反转和一个基因对的缺失。因此，Brainbow 2.0充当了默认RFP和CFP之间的切换，而Brainbow 2.1则从默认的GFP(绿色)切换到RFP、CFP或YFP荧光。在Brainbow 2.1中，GFP被标记一个核定位序列，使其定位到与CFP和YFP不同的细胞区域。
Brainbow的最新衍生，大脑彩虹3.0(Cai et al.， 2013)，融合了高光稳定性的荧光体mOrange2, EGFP和mKate2(红色)，以解决以前版本的Brainbow荧光强度低的问题。它是Brainbow 3.0开发的，使用了相同的荧光标记，Brainbow 3.1和3.2(在同一出版物中描述)是唯一的，因为默认情况下，它们不是荧光的。相反，他们将截短的、无荧光形式的YFP作为转基因的默认状态，这样重组是必要的，以去除无荧光的YFP，并激活下游的OFP、GFP或RFP的荧光。表达该结构但不进行重组的细胞可以通过截断的YFP免疫染色检测到。
在Thy1-Brainbow在老鼠中，一些神经元表达了多达16个被注射的转基因副本，每一个副本都可以重组以激活不同荧光蛋白的表达。因此，每个细胞都可以表达来自注射结构的所有荧光蛋白的独特组合。金宝搏app下载在单个细胞中表达的荧光蛋白在整个细胞中都能保持其颜色，即使轴突长度可达100微米。
Brainbow系统的一些挑战是，它没有使用普遍存在的启动子，这意味着不是所有的细胞类型都可以被标记，虽然转基因的多个副本可以整合到细胞中，但这些XFP的表达水平不够强，不能用于所有的应用。为了解决这个问题，类似的系统已经被开发出来，用于追踪各种细胞类型和生物，并用于提高大脑随机多色标记的细节水平。
标签果蝇与dbrainbow和flybow的神经元
基于Brainbow 1.0系统，果蝇大脑彩虹（dBrainbow；Hampel等人，2011)在成神经细胞阶段标记果蝇神经元，这意味着同一谱系的神经元将在成年果蝇中表达相同的XFP转基因。由于停止盒直接位于荧光蛋白基因的上游，所以在荧光发生之前需要Cre重组。Cre重组酶可与常用的、现有的Flp重组果蝇研究工具一起使用。除了结构中的XFP外，dBrainbow还包含了与每个XFP融合的小的表位。以这些抗原表位为靶点并发出与融合XFP相同颜色荧光的二抗可用于放大信号。活体动物的内源性荧光成像只能显示两种颜色。
同样的,Flybow适应Brainbow 2.0的使用黑腹果蝇在Flp重组酶的控制下。Flybow中的XFPs是膜系的，这使得该系统可以用于细胞扩展的可视化，如苍蝇视觉系统中的神经元，这在以前很难研究(Hadjieconomou et al.， 2011)。
斑马鱼与斑马鱼的细胞示踪
在斑马的世代之前(Pan et al.， 2011)， Brainbow也被用于斑马鱼，在胚胎阶段注射CMV-Brainbow结构体。这项技术可以通过将Brainbow放置在神经特异性启动子的下游，将Brainbow定位到神经元，或者通过在单细胞阶段注射Brainbow来标记整个鱼。斑马鱼，或称“斑马鱼脑虹”，是一组转基因斑马鱼系，可以为整个有机体或特定组织进行多色标记。XFPs是通过一种质粒结构引入的Zebrabow-GateDest含有RFP、CFP和YFP的泛在启动子的下游。斑马鱼是一种非常通用的技术，可以通过微注射Cre蛋白或将斑马鱼动物与可诱导的Cre系杂交来诱导鱼体的重组。的Schier集团开发了Zebrabow作为一个系统，利用了从Brainbow可能的多色标签。
用“五彩纸屑鼠”追踪克隆细胞群
对于哺乳动物系统，聪明的实验室开发了五彩纸屑鼠标(Snippert et al.， 2010)，一种报告小鼠，当与表达适当细胞的小鼠杂交时，可以用来跟踪任何细胞类型Cre等位基因。五彩纸屑鼠标包含了Brainbow 2.1结构Rosa26位点，在loxP“路障”下，这样XFP只在重组事件后表达。该小鼠组织特异性Cre重组产生的细胞在特定的细胞类型中随机表达核GFP、膜CFP、细胞质YFP或细胞质RFP。
“五彩纸屑鼠”最初被用来描述肠隐窝细胞的自我更新，从那时起就成为了解细胞增殖的有力工具。
诱导XFP在Ubow小鼠中的表达
另一种鼠报告动物Ubow小鼠(Ghigo et al.， 2013)，是由Brainbow 1.0- l构建，Brainbow 1.0的变体，包含RFP、CFP和YFP。在与三苯氧胺诱导的泛素背景杂交后，小鼠中每一个表达Cre的细胞都经历一次重组事件，导致每一个表达YFP或CFP的转基因副本，以及不表达Cre的细胞发出默认RFP的荧光。
乌博结构随后被用来开发一个跟踪朗格汉斯细胞命运的系统。在Ubow小鼠中，表达YFP、CFP和RFP的细胞并不以相同的频率出现。CFP++细胞的小群体大小允许研究人员纵向绘制真皮层朗格汉斯细胞的更替图，并确定朗格汉斯细胞是通过特异性的(不是全部的)朗格汉斯细胞的增殖来补充的，以创建增生的细胞灶。
Tetbow针对当前技术优化了Brainbow
Tetbow (Sakaguchi et al.， 2018)通过加入aTet-Off系统促进XFP表达。Tetbow增加的亮度使得该系统可以在多视场中追踪毫米长的神经元，而之前的Brainbow技术只能在一个视场中识别神经元。Tetbow可以介绍在活的有机体内要么通过电穿孔质粒，要么使用AAV载体。
的Imai实验室也开发了一个版本的Tetbow，它融合了化学标签而不是XFP，以优化组织清理，一种使组织，如大脑，透明的方法，这样荧光神经元的三维结构是可见的。化学标记对组织清除方法更有抵抗力，可以用合成荧光团进行标记，这种荧光团比荧光蛋白更稳定。金宝搏app下载要了解更多细节，请查看这个博客来自开发了Tetbow的研究人员。
结论
随机多色细胞标记系统允许在各种生物中的单细胞动态比以往任何时候都更详细地观察。随着科学家继续开发这些技术的新迭代，期望看到系统使用更新，更稳定的荧光团，并可以与新的成像技术相结合。
参考文献
蔡道文，等。“改进了Brainbow工具箱的工具。”自然方法10.6(2013): 540。PubMedPMID: 23817127．公共医学中心PMCID: PMC3713494．
Ghigo, Clément等。朗格汉斯细胞稳态的多色命运图实验医学杂志210.9(2013): 1657 - 1664。PubMedPMID:23940255．公共医学中心PMCID: PMC3754858．
哈吉economou，达夫尼等。果蝇神经回路分析的遗传多色细胞标记自然方法8.3(2011): 260。PubMedPMID:21297619．
Köhler, Corinna等。突变BRaf诱导的小鼠皮肤黑色素瘤源于成熟色素黑素细胞的扩张和去分化。细胞干细胞21.5(2017): 679 - 693。PubMedPMID:29033351．
利维特，简等。神经系统中荧光蛋白组合表达的转基因策略金宝搏app下载自然450.7166(2007): 56。PubMedPMID: 17972876．
Pan, Y. Albert等。“斑马鱼的多色脑虹成像。”冷泉港协议2011.1 (2011): pdb-prot5546。
理查森，亚历山大等。“在角膜缘干细胞缺乏的小鼠模型中观察移植k14 -五彩纸屑角膜上皮的命运”调查眼科学和视觉科学59.3(2018): 1630 - 1640。
Sakaguchi, Richi, Marcus N. Leiwe, Takeshi Imai。用荧光蛋白和化学标签对神经元电路进行明亮的多色标记。金宝搏app下载eLife7 (2018): e40350。PubMedPMID: 30454553．公共医学中心PMCID: PMC6245733．
Snippert, Hugo J，等。肠隐窝稳态是对称分裂的Lgr5干细胞之间的中性竞争的结果。细胞143.1(2010): 134 - 144。PubMedPMID:21205846．公共医学中心PMCID: PMC3082469．
塔尔洛，布兰登D，米尔顿J.费恩戈尔德，马库斯格罗普。小鼠卵圆形细胞损伤中Sox9+肝祖细胞的克隆示踪肝脏病学60.1(2014): 278 - 289。PubMedPMID:24700457．公共医学中心PMCID: PMC4077948．
杨志强，等。“肠道干细胞标记物Bmi1和Lgr5确定了两个功能不同的群体。”美国国家科学院院刊109.2(2012): 466 - 471。PubMedPMID:22190486．公共医学中心PMCID: PMC3258636．
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