注：Cpf1也称为Cas12a。
CRISPR-Cpf1基因组编辑有了新的进展最近的一篇论文从张峰的实验室描述如何使用Cpf1进行多重基因组编辑。由于一些原因，与Cas9相比，Cpf1是编辑多个目标的简化系统。请继续阅读以了解有关Cpf1多路复用的更多信息。有关Cpf1的深入回顾，请访问这博客帖子或查看Addgene的CRISPR指南页有关Cas9的回顾。有关Cpf1与Cas9的简要比较，请参见下表。
表1.比较Cas9和Cpf1 CRISPR核酸酶
| Cas9 | Cpf1 | |
| 组件 | crRNA tracrRNA Cas9 |
crRNA |
核酸内切酶的大小 |
spCas9: ~ 4 kb |
约3.9kb |
| crRNA / gRNA长度 | 格娜：~100新台币 | 新界北42号 |
| 需要tracrRNA吗？ | 对 | 没有 |
| 双链DNA断裂 | 钝端 | 5 '过剩 |
| PAM序列 | NGG | TTTV |
| PAM站点保留了吗？ | 通常毁坏 | 是的，Cpf1切割5'的原间隔 |
在Cpf1 crRNA阵列之前多路复用CRISPR-Cas9选项
在这个新的Cpf1多路复用方法之前，其他多重CRISPR基因编辑方法完全依赖Cas9。总体而言，这些方法有两个主要缺点：
1)大多数依赖于转染一个以上的载体来表达gRNAs和Cas9。由于拷贝数的差异，共转染会导致表达水平的变化。通常转染也有缺点:瞬时表达和需要与可转染细胞系一起工作。
2)它们需要更大的表达载体，而通常更难以转染或包装成病毒载体。188完整比分直播Cas9多路复用载体更大，因为它们需要调节序列来允许多个gRNAs(如Csy4切割序列、tRNAs、多个单个启动子)的表达。spCas9及其gRNAs也比Cpf1更大。
表2。Cas9复用选项
| 多路复用方法 | 交付方式 | 优势 | 缺点 | 参考文献 |
| 山本实验室金门组件 | 转染 |
一个载体表达Cas9和多达7个gRNAs |
每个gRNA都需要自己的启动子 |
|
多重慢病毒表达盒 |
慢病毒转导 |
一个载体表达Cas9、eGFP和多达4个gRNAs | 每个gRNA都需要自己的启动子 | Kabadi仍等 |
| Csy4可切割盒式磁带 | 转染 | 从多顺反子转录本表达的gRNAs | 需要共转染Cas9 | Nissim等人 蔡等 |
| PTG磁带 | 转染 | 从多顺反子转录本表达的gRNAs | 需要共转染Cas9 | 谢等 |
用Cpf1复用crRNA表达式
与Cpf1复用crRNA表达的关键优势是Cpf1可以处理自己的pre-crRNA阵列。Zetsche等人通过显示Cpf1可以切割4个crRNAs的阵列来证明这一点体外在293细胞中表达。这允许单个启动子驱动crRNA阵列的表达，而不需要其他内切酶的表达，如Csy4，或包含加工信号，如tRNAs，将阵列加工成功能性crRNA。
Pro-Tip
Cpf1处理其自己的预crRNA阵列的能力将其scrRNA克隆过程。对于克隆，Zetsche等人使用了由直接重复和crRNA组成的四种寡聚体。类似于拼图游戏，oligos被设计成粘性末端，只在一个方向上退火。请参阅下面的图表以了解其工作原理。一定要订购5 '磷酸化寡糖或T4 PNK。
Cpf1多路传输选择:转染、慢病毒和AAV
Cpf1处理其自身的前crRNA阵列的能力消除了需要包括多个启动子来驱动crRNA表达和允许阵列处理的序列，即tRNAs或Csy4裂解位点。这消除了crRNA表达质粒的大量，从而产生更小、更精简的载体，更易于跨多个载体使用表达平台：转染、慢病毒转导和AAV转导。在Zetsche等人的大多数实验中，使用了单一载体共表达Cpf1和crRNA阵列。通过转染，当在单个质粒上转染4个crRNA、Cpf1和GFP标签阵列时，6.4%的HEK293T细胞在4个靶点中的4个有编辑。这与转染质粒池（每个质粒含有一个crRNA和一个Cpf1表达载体）的2.4%的细胞相比较。参见图2中的图表，比较转染单个质粒和合并质粒的编辑频率；对于多次编辑，单个质粒通常更有效。
Pro-Tip
当从慢病毒载体表达Cpf1多重系统时，一定要逆转crRNA的直接重复序列的方向。慢病毒携带DNA序列的(+)链RNA拷贝，这是Cpf1的合适底物。这意味着Cpf1可以结合和切割慢病毒RNA，防止病毒包装。逆转直接重复的方向可以保护(+)链慢病毒RNA免受cpf1介导的切割。这种逆转也会阻止crRNA阵列在细胞中表达时的加工，但请注意Zetsche等人是如何逆转驱动crRNA阵列表达的启动子的方向的(红色粗体箭头)。这就解除了直接重复的原始逆转，导致了可被Cpf1处理的crRNA阵列的表达。
最后，一个AAV载体用于在小鼠神经元原代培养中多重编辑3-4个基因体内．在这些实验中，两种aav以1:1的比例感染细胞，一种表达Cpf1，另一种表达crRNA阵列加GFP标签。感染4周后，靶脑区Cpf1和GFP表达强烈，约75%的神经元与Cpf1和GFP共转导。在这些神经元中，约15%的神经元在所有3个靶点上都有内膜。参见下面的图表来了解多路复用效率体内．
利用CRISPR-Cpf1进行多重基因编辑是CRISPR技术的最新发展之一。这是一种简单有效的方法，具有多种应用(体外,体内(如转染、病毒转导)，可以用单个crRNA阵列同时进行多基因编辑。
你是我吗对在您的研究中使用Cpf1多路复用感兴趣吗?检查Cpf1复合质粒从Addgene可用。如果你对Cpf1多路复用有任何问题或想法，请在下面的评论中留下。
参考文献
1.Zetsche等人，“通过CRISPR–Cpf1使用单个crRNA阵列进行多重基因编辑。”自然生物技术35.1（2016）：31-34.PubmedPMID:27918548。
2.Zetsche，B.，Gootenberg，J.，Abudayyeh，O.，Slaymaker，I.，Makarova，K.，Essletzbichler，P.，Zhang，F.（2015）。Cpf1是2类CRISPR-Cas系统的单一RNA引导内切酶。手机，163(3), 759-771. PubMed采购经理人指数：2642227公共医疗中心PMCID: 4638220．
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