支原体污染:它从哪里来以及如何预防

这篇职位由Guest Blogger，Kaustubh Kishor Jadhav是MGMS Biosciences of Technoloctions研究所的一家研究助理。

如果您正在阅读本文，那么您可能怀疑您的细胞文化中的支原体污染，或者您即将开始新的细胞文化项目。如果您的实验室存在mycoplasmas，请不要惊讶。它们存在于大多数细胞培养设施中，组织培养实验室和每个细胞培养师都必须处理这个问题。据估计，支原体负责高达60%的细胞培养污染（Uphoff，2002）。

支原体被认为是最简单和最小的细菌之一。没有刚性细胞壁使它们耐抗生素和青霉素和链霉素等抗菌药物。支原体可以通过过滤方法，因为其能够改变形状和不存在刚性细胞壁。在这里，我将在进入您的细胞文化之前涵盖一些最佳方法来解决支原体污染，如果您遇到支原体污染，该怎么办。

支原体污染的原因

支原体通过各种难以追踪的来源进入细胞培养。这些包括实验室人员、血清、细胞培养基、水浴、培养箱等。其中，人类污染是最大的污染源。污染物可以通过脏衣服、实验室穿着、层流附近的人类语言、人类头皮、打喷嚏、咳嗽等传播。此外，无论细胞培养物在哪里，不断的人员流动也会增加污染的风险。

支原体可以通过交叉污染和较差的实验室技术从这些来源传播。这些措施包括为多个细胞系重复使用移液管，而不是使用一次性移液管或重复使用手套。血清也是支原体污染的一个来源。由于其浑浊的性质，很难在血清中检测到污染，而血清是最常用的每一种细胞培养。每次继代重复使用同一瓶血清可促进支原体的生长。血清营养丰富，是支原体增殖的最佳来源。另外，它是在高压灭菌后添加到培养基中，因此，不能保证血清是无污染的。

在层流中工作时(说话或移液时)产生的气溶胶也是造成污染的主要原因之一。这些气溶胶会在传代过程中进入培养基，如果细胞系暴露的时间较长，则会从空气中进入培养基。这些气溶胶肉眼是看不见的，因此在它导致污染之前是无法探测到的。

问题的另一个来源是用于传递的介质，其以液体和粉末形式可用。由于处理不当或差的实验室技术，支原体可以通过这种形式的粉末介质传播。过滤不能确保完全灭菌，因为支原体甚至可以逃脱0.2微米过滤器。

图1：污染！组织培养基通常具有包含在培养基中的指示剂，其由于微生物污染而从降低的pH从降低的pH变化。照片由Kaustubh Kishor Jadhav。

支原体可停留在干燥状态较长时间。当它们接触到营养来源时，它们很快就开始增殖。一旦它们出现在实验室环境中，就很难根除。你可以抑制支原体的生长，但不能完全根除它。当培养物中发现支原体时，最好扔掉烧瓶(除非培养物的来源不可替代或非常昂贵)。

检测支原体污染

用肉眼或光学显微镜检测支原体是非常困难的，那么你怎么知道它的存在呢?对于这项任务，你可以使用基于PCR的检测，DNA染色，荧光标记，琼脂电镀等。明智地选择下面列出的任何一种方法，并始终使用第二种方法以100%确定。在检测支原体前，细胞应连续培养至少两周为生长的低水平污染提供时间．对于测试，在取样前至少2 - 3天不应更换培养基(乌普霍夫和德雷克斯勒，2011)。

• 在琼脂板/肉汤上培养被认为是检测支原体的“金标准”。在这种方法中，将细胞培养的上清加入到液体或半固体培养基中(含有支原体生长所必需的营养物质)。受感染细胞培养在培养液和琼脂平板上都有生长。支原体菌落在琼脂平板上很容易看到。该方法能检测出除少数支原体外的大部分支原体。
• 另一种用于支原体检测的方法是PCR。本技术使用了针对各种常见感染支原体16s RNA基因的PCR引物。广泛的引物涵盖了几乎所有的感染支原体。在这个过程中使用的引物要么是物种/基因特异性的，要么是通用的。该方法快速、高效、可靠、经济(Sung, 2006)。
• 基于传感器细胞的方法使用专门的细胞，可以检测培养中支原体的存在。一旦这些细胞检测到支原体，它们就会触发一系列化学反应，从而导致明显的颜色变化。这种方法有高灵敏度但特异性低(Degeling, 2012)。
• 生物发光检测试剂盒可从不同的生物技术公司是基于酶的支原体检测试剂盒。这些试剂盒检测不是由真核细胞合成的支原体酶。首先，试剂盒成分破坏支原体，然后使用特定的酶触发产生发光的细胞机制。然后可以用光度计来检测。
• 在感染培养基中加入非特异性DNA染色可检测支原体。当在荧光显微镜下观察时，支原体DNA以小簇的形式出现，除了细胞DNA。
• 荧光DNA染色是另一个DNA染色替代方案。该方法使用DAPI和Hoechst 33258等DNA污渍染色所有DNA。在这个过程中需要一些专业知识，因为结果解释可能很困难。支原体的低密度，由这些细菌产生的其他细菌或细胞外荧光信号的污染可以阻碍正确的结果解释。此外，来自核区域的信号使支原体的检测变得困难(Ligasova, 2019)。

支原体污染的预防

避免支原体的最好和最重要的方法是为实验室工作人员提供适当的培训和指导。这可以通过培训合格的人员进行细胞培养过程，从而消除污染的原因之一。如有可能，应设立单独的实验室进行细胞培养和细胞系维护。为实验室设施提供这样一个环境，不仅可以减少支原体，还可以避免其他细菌和真菌污染。

适当的个人防护用品

由于人类是污染的主要来源，预防步骤从你开始。如果你足够细心地为工作提供一个无菌的环境，在你意识到之前，它将很快成为一种习惯。这里有一些事情要做:

• 处理细胞系的同时穿清洁实验室外套和面具。
• 避免与其他实验室成员进行讨论，在实验室中打喷嚏或咳嗽。人口含有各种各样的支原体，当你谈话，笑，打喷嚏或咳嗽时，这些都可以进入细胞文化。
• 工作时戴手套，使用后丢弃。当你不戴手套或口罩工作时，人类接触可能会传播污染。一定要定期更换手套和口罩，而不是把它们放在实验室大褂的口袋里。
• 为实验室准备单独的鞋子，以避免带入环境污染物。

图2:Addgenie穿着个人防护装备在组织培养罩中工作。Kate Harten DeMaio拍摄。

细胞系和试剂

• 在使用前检查您的蜂窝线库存中的支原体污染。
• 确保用于传代培养的血清中不存在污染。避免使用过期的产品或已储存较长时间的试剂。
• 尽可能使用新鲜介质，并将其紧密包装在一起。
• 使用一次性移液器以避免交叉污染。
• 确保在您工作之前和虽然在工作前持续所有所需的设备和试剂。
• 在使用细胞系进行分析或分析之前，进行支原体污染的常规检查。
• 使用0.1微米的过滤器是避免支原体的更好方法，而不是使用0.2微米过滤器过滤介质。没有100%的保证这个过程可以避免污染，但这是一个很好的预防实践。
• 准备少量培养基原料用于实验，防止其余培养基污染。
• 避免长时间曝光细胞培养到空气，并确保在将它们放入培养箱之前拧紧瓶盖。这也将解决通过气溶胶的污染问题。
• 在不使用抗生素的情况下进行培养，因为使用抗生素会导致支原体对抗生素产生耐药性。抗生素只能用于去除支原体，不能用于防止支原体生长。此外，长期使用一种特定的抗生素会导致除支原体以外的其他细菌产生耐药性。
• 即使冷冻保存的细胞的可行性随着每种媒体的降低而降低，始终以冷冻保存的小瓶的形式备份。

设备

• 定期对层流气流和实验室设备进行熏蒸。
• 的有限公司₂用于培养细胞系的培养箱不能过于拥挤(容量不能超过60%)，否则可能导致支原体从一个细胞系感染到另一个细胞系。
• 由于它增加了交叉污染的风险，多个细胞系不应存储在单个孵化器中。
• 二氧化碳培养箱应定期清洗，避免任何形式的潮湿。应定期更换用于维持湿度的蒸馏水，因为支原体、细菌和真菌可能在这些容器中居住。
• 清理任何媒体或文化立即溢出。
• 水浴槽、液氮容器、试剂瓶和其他感染源必须定期清洗，并定期检查是否受到污染。

有关更多提示，请查看addgene的视频在下面的组织文化中入门！

检测后清除支原体

你发现了支原体污染，下一步怎么办?最好的方法是丢弃受感染细胞培养瓶。在文化不可替代或非常昂贵的情况下，有一些方法来拯救文化。

消除是一个非常耗时的过程，并增加了对其他健康细胞系的二次污染的风险。支原体去除剂(MRA)是喹诺酮类抗生素的衍生物，是广谱抗生素。这些试剂可用来清洗细胞培养物。根据感染的严重程度，治疗可能需要几周到几个月的时间。浆胞素是一种广泛使用的药物，可以清除培养基中存在的大部分支原体。此外，还可使用BM Cyclin、氟喹诺酮环丙沙星、西普罗培、扎甘、贝曲利、四环素等药物从受感染的培养物中清除支原体。

mra无毒，有效地清除大部分支原体污染，易于使用，并对广泛的支原体有效。这些方法不能保证完全清除支原体，但可以清除大部分支原体污染，是最后的选择。在考虑这种治疗时，有一些缺点，因为治疗的时间会影响细胞的生长和活力。如果支原体对细胞培养造成了永久性损害，则是无法修复的。有些细胞可能会由于较长的潜伏期而死亡，并影响细胞的总活力。

结论

总而言之，预防污染总是比以后根除污染更重要。当支原体感染细胞培养物时不要害怕，因为你不是第一个遇到这种问题的人。尽可能地教育其他人，帮助他们了解防止污染的重要性。保持清醒和谨慎，而不是通过艰难的方式学习它!

非常感谢客座博客Kaustubh Kishor Jadhav!

KAUSTUBH KISHOR JADHAV，MSC是印度MGMS生物科学研究所的研究助理。Jadhav在硕士学位（米兰，意大利大学）和生物技术学士学位有硕士学位。

参考文献

Degeling MH，Maguire CA，Bovenberg MSS，Tannous BA（2012）哺乳动物细胞培养中的支原体检测的敏感测定。肛门化学84：4227-4232。https://doi.org/10.1021/ac2033112

Ligasová A, Vydržalová M, Buriánová R, Brůčková L, Večeřová R, Janošťáková A, Koberna K(2019)使用荧光显微镜检测支原体的新方法。细胞8:1510。https://doi.org/10.3390/cells8121510

宋赫，姜树华，裴玉杰，洪振堂，钟彦波，李志强，宋s(2006)支原体的pcr检测。J Microbiol .44: 42-49

乌普夫Cc，德雷克斯勒Hg(2002)比较抗生素消除支原体感染的连续性细胞系．体外细胞驱动Biol Anim 38:86。https://doi.org/10.1290/1071-2690(2002)038,10086 :caeomiely2.0.co;2

Uphoff Cc，Drexler Hg（2011）通过聚合酶链反应检测细胞培养物中的支原体污染。在：分子生物学中的方法。Humana Press，PP 93-103

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