在之前的一篇博客文章中，我们讨论了如何利用荧光蛋白构建蛋白质金宝搏app下载生物传感器这是一种监测过程或检测分子的生物工具。在这里，我们将深入了解SF-iGluSnFr的细节，这是一种最近升级的用于检测谷氨酸的生物传感器。
iGluSnFr的起源
iGluSnFr于2013年由罗兰Looger的实验室使研究人员能够监测神经元和其他脑细胞的谷氨酸释放体内．谷氨酸在突触通讯中发挥多种作用，并能触发其他形式的神经元信号和调节。
为了创造iGluSnFr, Looger实验室将GFP嵌入细菌衍生的周质谷氨酸结合蛋白GltI的两半之间。当融合蛋白与谷氨酸结合时，构象变化导致插入的GFP的荧光强度增加。
在描述iGluSnFr体外Looger实验室的研究表明，iGluSnFr可以检测大脑中的神经元活动秀丽隐杆线虫，斑马鱼和老鼠。
升级到iGluSnFr
尽管这是一个有用的工具，但对于需要高信噪比或高频谷氨酸信号事件成像的实验来说，第一个版本的iGluSnFr并不理想。因此，Looger实验室在三个主要方面对iGluSnFr进行了改进在这里. 研究人员做了以下工作：
- 增加iGluSnFr的亮度
- 创建具有不同谷氨酸结合动力学的新iGluSnFr变体
- 创建了蓝色和黄色iGluSnFr变体
增加亮度
在对iGluSnFr的第一次更改中，Marvin等人将eGFP交换为sfGFP，从而创建SF-iGluSnFr。这种改进的变体在细菌中有更高的表达水平，并最终在小鼠和雪貂模型中感知谷氨酸时产生更强的荧光信号。
通过不同的谷氨酸结合动力学增加了多功能性
虽然原iGluSnFr在细胞培养中对谷氨酸具有4 μM的生理亲和力，但这种相对较低的亲和力影响了以下设置下的性能:
- 需要低频信号检测、增加亲和性和高信噪比的实验设置
- 识别离散的、高频率的事件——这些需要较低的关联性(通过更快的关闭速率)来识别来自单个事件的信号
为了克服这些问题，Marvin等人对iGluSnFr融合蛋白的一个区域进行了突变，该区域已知对亲和很重要。这个所谓的“枢纽区域”的突变导致了两种有用的变异:
- SF-iGluSnFr。A184S(增加了对谷氨酸的亲和力)
- SF-iGluSnFr。S72A(对谷氨酸的亲和力降低)
Marvin等人进一步表明，与iGluSnFr相比，A184S变体对较低浓度的谷氨酸产生更强烈的荧光信号。另一方面，S72A变体更善于检测重复的高频事件，比如电刺激后神经元谷氨酸释放。有了这些变体，研究人员可以选择最适合他们实验需要的特定工具。
新的SF-iGluSnFr颜色
最初的iGluSnFr只有一种颜色——绿色。研究人员可能需要更多的颜色来描绘附近细胞中不同的信号事件，或者容易识别特定细胞类型中的谷氨酸信号。因此，Marvin等人交换了我们对iGluSnFr中GFP生色团的研究，并在必要时优化了GltI荧光蛋白键，以产生蓝色（SF蓝绿色iGluSnFr）和黄色（SF金星绿色iGluSnFr）变体。事实上，除了添加新的颜色外，黄色变体还可以通过廉价的1030 nm双光子飞秒激光成像，这种激光可以在一个样本中激发多个区域。有了这些SF-iGluSnFr结构，科学家们有了新的iGluSnFr颜色和激发它们的新方法！
在实验室中使用SF-iGluSnFr
新的SF-iGluSnFr变体应该能使科学家能够有力地检测大脑及其他地方的信号事件。Looger实验室在这里讨论的论文中重点关注SF-iGluSnFr在神经生物学中的应用，但正如他们在2013年的工作中所提到的，谷氨酸信号发生在许多环境中，可能对从事从细菌到动物到植物等生物研究的科学家有用。
的SF-iGluSnFr变体进来AAV从Addgene获得的载体。Looger实验室提供了一份用于表达SF-iGluSnFr变体的启动子系统的简要分析:
- CAG:通用强启动子。制定为AAV-DJ用于神经元表达。
- CAG启动子，在cre表达细胞中表达。
- hSynap:人类突触素-1启动子。对神经元表达有好处。
- hSynap-FLEX：Synanpsin-1启动子，可在Cre表达细胞中表达。
- 胶质纤维酸性蛋白（启动子）。有利于神经胶质细胞的表达（不是神经元）。
我们很高兴看到你如何使用这些伟大的新工具!
工具书类
1.谷氨酸传感器iGluSnFR的稳定性、亲和力和色度变体自然方法(2018): 936-939. PubMedPMID：30377363．
2.马文，乔纳森，等。"可视化谷氨酸神经传递的优化荧光探针"自然方法10.2(2013): 162。PubMedPMID: 23314171．公共医学中心PMCID:pmc446972．
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