谱系追踪的新工具：Clontracer库

泰勒福特

泰勒福特2015年9月22日

烧瓶用于大规模慢病毒感染 本文基于对诺华公司研究员Carrie Bhang的采访。

这Clontracer库卡丽·班格(Carrie Bhang)保存了这份研究报告诺华州肿瘤学，是一个令人兴奋的新工具，允许研究人员单独标记数百万哺乳动物细胞慢病毒感染并利用下一代测序(NGS)监测它们的丰度和克隆动态。图书馆是在卡莉还是博士后的时候建立起来的弗兰克Stegmeier诺华肿瘤学公司的实验室。

Bhang在约翰霍普金斯2012年1月来到诺华公司攻读博士后。她在目标识别和验证小组做了三年博士后，她说她决定做一个诺华州的DOC后因为她想要行业研究方面的第一手经验。当她来到诺华时，她惊喜地发现，“诺华实际上是以研究为导向的，有点类似于学术研究环境”，非常注重出版，但她仍然做到了这一点，这样她就可以“接触到药物发现的过程”。

ClonTracer库最初产生于Bhang和同事试图开发一种方法来量化细胞植入后小鼠异种移植的摄取率。他们的目标是找出如何优化协议在活的有机体内筛选与慢病毒汇集shRNA文库．后来，Bhang说:“当我们开发这个工具时，有很多有趣的问题，我们可以应用它。”

使用Clontracer研究耐药性

虽然Bhang和他的同事开始使用这个工具来研究围绕癌症发展、转移和耐药性的各种问题，但Bhang说“(药物)耐药性的故事很快就得到了证实”，并在最近进行了总结自然医学论文．在出版物中，Bhang和同事使用克隆者库，以确定治疗期间是否出现抗药性对药物治疗的癌细胞群体或在母体群体中预先存在于治疗之前。他们假设，如果使用库的标记母细胞群，将其传播，将其分成大致相同的复制基团，并用相同的药物方案处理这些组，它们会发现两个结果中的一个（见下文示意图）：

1.单独的重复中的抗性细胞包含相同的标签 - 即，它们总是来自代表预先存在的抗性亚贫困的相同的父母细胞

2。单独重复的抗性细胞具有不同的标记 - 即它们将从整个治疗方案的不同细胞转移出来，并且没有预先存在。

癌症耐药筛选的潜在结果:1)不同复制的耐药细胞将包含相同的ClonTracer标签，因为它们来自相同的既有耐药亲本细胞;2)来自不同重复的耐药细胞会有不同的ClonTracer标签，因为它们在整个选择过程中会随机来自不同的细胞，并且不是预先存在的。

这之前争论过癌症领域并且很难使用NGS来确定，因为当前NGS方法的错误率允许检测限大约为0.1％。因此，容易错过以低于总群体的罕见，预先存在的克隆以少于0.1％。

Clontracer库允许研究人员用特定分类，容易读取的序列标记单个细胞的单个成员，该序列可用于测量治疗前后的克隆丰度。该图书馆由一种慢病毒载体的池组成，其中大约7300万个半随机，30bp DNA188完整比分直播条形码，其在感染时被整合到靶细胞的基因组中。使用Clontracer系统时，含有这些条形码的慢病毒在低温下感染目标细胞群感染多重（MOI）这样每个单独的单元只接收一个条形码。然后可以通过测序群体中的条形码（所有条形码可以使用相同的正向和反向引物扩增）随时间监测每个条形码克隆的丰度。然后，特定条形码序列的丰度对应于特定克隆的丰度;通过条形码测序执行谱系跟踪。

利用ClonTracer库，Bhang等人发现抗生素耐药的癌细胞在药物治疗前就存在。他们用ClonTracer库感染了一个非小细胞肺癌细胞系，该细胞系含有表皮生长因子受体(EGFR)的激活突变，并在使用EGFR抑制剂厄洛替尼治疗后监测了种群动态。通过观察多个复制种群中的条形码丰度，他们发现，相似的条形码始终构成了大多数耐药种群。事实上，在耐药群体中，88%的条形码被至少一个其他复制共享;在治疗之前，有一小部分(以前无法检测到的)癌症细胞对药物治疗具有耐药性，这些细胞在治疗过程中被选择。作者继续表明，多重药物联合治疗揭示了更小的已经存在的人群对两种药物都有耐药性。

Clontracer的未来

自从在诺华肿瘤的体内药理学群中作为调查员开始新的角色，巩珠德一直在努力使用Clontracer库来监测细胞系和原发性肿瘤异种移植模型中药物治疗后的克隆动力学。她希望图书馆可用于识别药物开发的适当，非重叠的目标 - 这使得初始抗性群体可以快速消除。这种方法与当前治疗范例相反，在它们出现时处理耐药群体。在他们的自然药纸中，中间和工友还看着慢性髓性白血病中ABL1抑制剂的癌细胞抗性。邦德说，该工作强调了在诺华州开发更多有效的ABL1变构抑制剂的重要性。

ClonTracer文库已经分布在世界各地，最近被用于一项聚焦于肿瘤细胞对EGFR抑制剂耐药性的研究(Hata等人，2016年)．Bhang将该图书馆与Addgene存放在一起，因为她想让研究人员尽可能容易地在自己的工作中使用该工具。她说，“我花了很多时间打包、运输和一个接一个地分享协议，”她很高兴把这个库交给Addgene，因为它是一个“广泛分享这些类型的试剂的真正伟大的方式。”

在此处在Addgene中，我们很高兴看到您将Clontracer库使用使用的创造性新方法！

非常感谢Carrie和Novartis花时间与我们交谈，并为Addgene社区提供这个强大的资源!

Carrie Bhang是诺华肿瘤学体内药理学的研究人员，她特别感兴趣的是将我们对肿瘤异质性的了解应用于药物发现和联合疗法的开发。