新工具使CRISPRa能够用于神经科学应用

什么是基于CRISPR的激活？

总而言之,克里斯普拉使用Cas9核酸酶死亡变种(dCas9)和转录激活子工程组合，在特定sgrna靶向的基因组位点诱导基因转录。其受rna引导的特性使得CRISPRa在cDNA文库的全基因组筛查中实现起来容易得多。然而，使用CRISPRa靶向单个基因可能相对困难，因为需要多个质粒/病毒来传递所有的蛋白质和RNA成分，必须筛选几个sgrna来确定有效的。

简化体内维使用SPH小鼠

CRISPRa在很大程度上仅限于在体外由于Cas9活化剂的尺寸较大，这在很大程度上妨碍了通过腺相关载体（AAV）．这个问题最近被杨实验室随着……的发展Suntag-p65-HSF1（SPH）转基因小鼠(周等人，2018)。这只老鼠表达了“Suntag”Cas9激活子的一个修改版本，该激活子将多达20个p65-HSF1转录激活子拷贝招募到每个基因组结合的dCas9上(参见图1a中的转基因构建)。更重要的是，这个结构的表达是依赖于creo的，可以对其表达进行时空控制。构建或诱导Cre重组酶可通过AAV或与表达Cre的小鼠交配引入。

在使用gRNAs之前在在Vivo，他们应该被筛选的活动在体外然后打包成AAV在活的有机体内多重基因靶向也是可能的，并且仅受AAV包装限制（即，可以容纳多少个sgRNA表达盒）的限制。

SPH激活子的crea依赖性表达与AAV sgRNA传递结合，使SPH小鼠成为一种有吸引力的工具，用于探测CNS和单个神经元群体的特定亚结构中的基因功能关系。

Yang实验室的AAV质粒用于在神经元特异性启动子下表达Cre，包括钙调素依赖性激酶IIα（aCaMKII；兴奋性神经元）和突触蛋白-1（泛神经元）启动子（图1b）以及sgRNA在这里．

Neuron-optimized病188完整比分直播毒载体

另外，Cas9激活剂可以通过慢病毒，比AAV具有更大的封装能力。这种方法最近被天实验室他开发了神经元优化慢病毒载体188完整比分直播在体外和在活的有机体内CRISPRa（Savell et al.，2019）。这种双慢病毒系统将普遍存在的sgRNA（s）和mCherry（载体1）表达与细胞的神经元特异性表达配对dCas9 VPR(图2)，一个流行的Cas9激活器教堂的实验室.神经元特异性表达由突触蛋白1（SYN）启动子介导，该启动子在原代大鼠神经元中诱导CRISPRa的能力优于其他启动子，包括普遍存在的启动子，如EF-1α和CAG。

白天实验室利用他们优化的载体来突出CRISPRa相对于传统的cDNA过表达的一个关键优势:亚型特异性基因表达。基因亚型是指由同一基因产生但未翻译或编码区域不同的mrna。通常，每个基因亚型都有一个不同的转录起始位点。因为CRISPRa可以有针对性的基因组的任何地方,相对简单的使用CRISPRa有选择性地针对这些不同的转录开始网站为了更好地理解isoform-specific基因调控——至少比产生更加直接cDNA单独为每个基因同种型。

为了突出这一优势，他们选择了即早基因脑源性神经营养因子，它编码脑源性神经营养因子（BDNF）。脑源性神经营养因子在对神经元活动的早期反应中表达(因此，“即时早期”)，并通过促进神经元和突触的发育以及长期记忆的形成来调节神经元生理。的脑源性神经营养因子基因具有9个不同的转录起始位点，所有位点都产生相同的BDNF蛋白。为了证明CRISPRa可以达到的特异性，Day实验室挑选了两个脑源性神经营养因子用于研究的亚型（I和IV）。原代大鼠神经元与dCas9 VPR和靶向任一转录变体的sgRNAs的共转导导致靶向变体的强烈和特异性上调，而不诱导非靶向变体的表达。

的异构体特异性表达脑源性神经营养因子导致了数百个基因的差异表达Bdnf我-过度表达神经元和第四脑源性神经营养因子-overexpressing神经元。在基因上调中Bdnf我和第四脑源性神经营养因子过度表达变异是其他与神经元活动相关的即刻早期基因，如Fos,Egr3,弧．因此，CRISPRa代表了一个强大的方法来解剖个体和共享的转录亚型对神经元生理学的贡献。

白天实验室的神经元优化慢病毒载体可以找到188完整比分直播在这里．

高通量筛选策略

尽管上述工具使神经科学家更容易使用CRISPRa，但并非所有的神经科学应用都需要此类优化工具。Qi实验室（其开发了胚胎干（ES）中亚基因组规模的CRISPRa筛查方法）优雅地证明了这一点确定哪些转录因子促进神经元分化的细胞（Liu等人，2018）。本实验的混合性质需要荧光激活细胞分选（FACS）在筛选过程结束时，从未分化细胞中分离出分化细胞。然而，虽然神经元标记物TUJ1有助于通过免疫组织化学观察神经元分化，但它不适合FACS。因此，研究人员插入了人类CD8，这是一种编码表面蛋白的基因，该蛋白具有良好的流式细胞抗体，位于TUJ1编码序列的下游。稳定表达dCas9-Suntag激活子的ES细胞被转导到汇集的sgRNA库，随后培养近两周，以允许分化发生。然后分离CD8+细胞并进行基因组DNA测序。正如预期的那样，靶向几种已知和未知神经元分化调控因子的Guide rna在CD8+人群中富集。

虽然这一策略被用于研究神经元分化，但它也可以应用于其他CNS细胞类型的分化，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，只要使用这些细胞类型的特异性报告基因。许多CNS常驻细胞类型缺乏良好的流式细胞仪抗体（小胶质细胞是一个显著的例外）对于敏感的应用，如CRISPR筛查，必须进行这种分子体操。

Qi实验室用于此特定应用的质粒可以找到在这里．

为什么是克里斯普拉？

虽然cDNA过表达方法仍可能是最佳的个体基因激活选择在体外和在活的有机体内应用程序，上面描述的工具使CRISPRa在大脑中相对容易使用。CRISPRa还非常适合其他应用，包括研究mRNA剂量效应、细胞重编程和疾病建模。此外，在离散细胞群体中缺乏crea依赖的小鼠系过度表达基因，使得crea依赖的SPH小鼠成为一个有吸引力的选择。

无论你的应用是什么，首先问问你自己，基因过表达是否必要(而不是基因敲除或敲除，通常有更多的基因策略)，然后考虑传统的cDNA过表达是否适合你的实验目标。如果没有，那就试试CRISPRa吧!

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非常感谢我们的客座博主，来自罗切斯特大学医学中心的帕特里克·米勒-罗兹。

Patrick Miller Rhodes目前是罗切斯特大学医学中心的鲁思L.Krsistin NRSA的前研究员，他研究了CCRPRA作为中枢神经系统实验室的成员在UrMC的Gelbar实验室中的基因功能关系。

参考文献

CRISPR激活筛选系统地识别驱动神经元命运和重编程的因素细胞干细胞23.5(2018): 758 - 771。PubMedPMID:30318302公共医疗中心PMCID: PMC6214761．

等。“一种神经元优化的CRISPR/dCas9激活系统，用于健壮和特异的基因调控。”eNeuro6.1(2019)。PubMedPMID: 30863790公共医疗中心PMCID: PMC6412672．

周海波，等。“利用CRISPR-dCas9-activator转基因小鼠，在体内同时激活大脑中多个基因的转录。”自然神经科学21.3(2018): 440。PubMedPMID: 29335603．

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