除了单个质粒外，Addgene还分布汇集质粒库包含数百、数千甚至一百万个质粒。这些库是Addgene最激动人心、功能最丰富的产品之一！我们最近重新扩大了我们的分销库存布鲁内罗人类gRNA图书馆，我们认为现在是讨论我们用于确保高质量图书馆分发的放大和验证过程的好时机。当您需要为自己的实验放大库时，也可以使用这些提示作为起点。
图书馆放大101
库放大似乎很简单：大肠杆菌细菌被库DNA转化，它们生长和复制，然后收获它们的DNA，就像一个人准备一个单独的质粒一样。然而，筛选实验需要大量的文库DNA，因此DNA制备的规模较大。由于该文库包含许多质粒，必须注意确保所有这些质粒都被扩增，并且没有丢失。
每个Addgene库都有自己的寄存者转换和扩增协议，但大多数库的总体工作流程是相似的。以下是进行库放大和测序时需要记住的要点。
在转换期间维护库的表示形式
首先，使用足够的DNA和DNA活性细菌以确保表示库的所有组件。通常，Addgene在进行扩增时使用电兼容的Stbl4细胞，我们使用电穿孔来确保良好的转化效率。对于一个典型的文库，Addgene通常使用总共约400ng的文库DNA进行四到八次电穿孔反应。这些反应应该允许我们在文库中每个质粒获得大约100到1000个细菌菌落。
细菌生长也必须优化以保持文库的多样性。如果文库中的各种质粒大小不同，较小的质粒可能会优先扩增，从而扭曲最终回收的DNA的组成。这种偏见可以通过在固体培养板上培养细胞来抵消，每个转化子在固体培养板上形成自己的菌落，不受其他细胞生长的影响。对于质粒大小非常相似的文库，如gRNA文库，这一点不太重要，但Addgene仍然建议将转化混合物镀在固体培养基上。然后将菌落从培养皿上刮下，制成颗粒进行DNA提取。
为下一代测序准备库产品
一旦提取出DNA，应使用下一代测序（NGS）确认文库的表达。对于gRNA文库，您将设计引物，使用聚合酶链反应. 我们为Brunello库创建的产品图如图2所示。你可以使用一个小PCR产物，因为库中的质粒除了插入物外是相同的；不需要对质粒的其他部分进行测序。
你如何知道你的测序结果是否代表成功的扩增？为了提供参考点，Addgene通常使用扩增前和扩增后DNA制备NGS样本，并从两者生成PCR测序产物。然后对这些产品进行纯化、定量并发送测序。
分析测序结果
如果你的测序成功，你的NGS提供者应该以许多短DNA序列的形式返回结果，称为阅读. 通常情况下，它们将位于中的一个文件中FASTQ格式，一种标准格式，用于存储NGS读取及其相应的排序质量。一般来说，您希望库的覆盖率达到100x-1000x：换句话说，比库中质粒的数量多读取100-1000x。同样，分析读取似乎很简单——您需要计算在读取列表中找到每个库组件的次数。如果你也对扩增前的DNA进行了测序，你会比较之前和之后的数字。然而，因为有成千上万的读者，如果不是数百万的话，这种分析必须以自动化的方式进行. Addgene通常使用来自Feng Zhang实验室的count_spacers.py文件的自定义脚本。还有许多其他可用的分析脚本，其中一些与特定的库关联，但是任何分析脚本都应该返回相同的输出：读取计数的电子表格。
您可以使用这些计数来确认库的表示形式。当绘制为柱状图时，计数将给出库中每个成分丰度的钟形曲线。你应该寻找两样东西：代表性不足的质粒（丢失或“丢失的质粒”）和代表性过高的质粒（优先扩增的质粒）。
您还可以按丰度对质粒进行排序，比例为1，以创建“累积财富分布”曲线或洛伦兹曲线。通过计算曲线下面积（AUC），可以了解库分布的均匀性，AUC为0.5表示完全均匀（见图3A）。Addgene发现这种表示法在视觉上最容易理解。作为一个例子，我们最近放大的布鲁内罗库的曲线也如图3所示。我希望你能同意我的观点，他们看起来非常相似——这正是我们想要的！
在一天结束时，由你决定好的扩增的阈值，但是通过查看这些图表，确保很少/没有质粒丢失，并比较扩增前和扩增后的测序结果，你应该能够确定扩增的成功。
我希望这篇文章有助于澄清使用、扩增和验证汇集的质粒库时的一些重要注意事项。集合库可以是一个强大的研究工具，但它们的正确使用需要仔细放大并保持良好的表现力。Addgene祝您在未来的图书馆使用和筛选中好运，如果您有任何关于图书馆使用的提示、输入或有趣的故事，请在评论中告诉我们！
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