优化供体DNA增强CRISPR基因组编辑

客人的博客

Guest Blogger.2016年3月24日

这个职位是贡献的来宾博客克里斯·理查森，博士后研究员雅各玉米的实验室。

CRISPR-Cas9 (Cas9)是一种RNA指导的核酸酶靶和切割基因组DNA。Cas9之间的相互作用（这会导致断裂）和宿主细胞DNA修复因子（其修复这些时间），使作为基因组编辑试剂Cas9极其有效的。这种相互作用分为两大类，因此，使得两种类型的编辑结果：通过修复Cas9断非同源末端连接（NHEJ）途径破坏靶基因序列（从而失活的基因），而断裂通过同源性定向修复修复（HDR途径可以改变基因的序列(从而改变其功能)。HDR对于某些应用是至关重要的，例如，纠正导致镰状细胞性贫血的等位基因。然而，HDR的发生频率远低于NHEJ，这些编辑反应的效率较低。理解这种修复偏差的生物学原因是一个迷人的(但尚未回答的)问题。我们最近的论文(理查德森等人2016）透露了一些能够影响HDR / NHEJ决定生物物理参数。

我们的结论强化了一个关键的科学原则:对生物过程的详细理解往往会为控制这一过程提供新的策略。我们从一个简单的问题开始我们的研究:Cas9和sgRNA如何与DNA靶标相互作用并分离?这个问题令人惊讶的答案促使我们开发了一种新的、合理的方法来提高HDR序列替换的效率。

理解Cas9生物物理学可以增强HDR

我们首先测量Cas9分解率和发现核酸解离的催化活性形式的约6小时DNA引入切，与停留时间后，非常缓慢。令我们惊讶的是，我们测量了催化活性的dCas9分子解离相同的利率。我们跟着这些实验更详细的调查后DNA切割的释放。使用标记在断裂的两侧的底物DNA，我们确定Cas9紧紧到三个切割的双链体的四股的保持，而第四链（如下面的图1中的释放链）可以自由地退火到互补ssDNA分子在体外．

接下来，我们想知道，如果我们可以利用这个模型（从建成在体外研究），以提高序列更新换代的效率在活的有机体内．我们发现，单链供体DNA：

为了补充释放链，
127个基点的长度,
在断口的远端为36bp，近端为91bp，

与其他设计参数的单链或双链供体DNA相比，始终支持更高的基因编辑频率(高达60%!)单链供体DNA的例子和推定的作用机制在图2.．

dCas9允许序列替换而不切割

我们的在体外结果还表明，催化失活的dCas9产生在未切割的靶DNA“泡沫”结构，这是与互补单链DNA退火访问。因此，我们想知道，如果这样的结构可以推动细胞顺序更换。靶向3个dCas9分子至大约1％的精确间隔开的区域允许的序列替代率。这绝不是大量的，但它是获得没有任何通常伴随切削Cas9容易出错的维修。We still don’t know the mechanism underlying dCas9 editing, but it could be very useful to tackle genetic diseases in which sequence replacement holds some kind of fitness advantage but error-prone repair of the gene would be disastrous (i.e. if breaking the gene is worse than leaving the mutation alone).

CRISPR通过核感染传递

这在活的有机体内使用称为核转染技术，它引入了官能Cas9蛋白质和靶向导引RNA导入细胞通过电穿孔进行该出版物中编辑实验。从我们的实验室和其他人的结果（Lin等人2014那理查德森等人2016,Kim等人2014)的研究表明，这种技术支持极高频率的基因组切割，并且，当供体DNA包含在核感染反应中时，也支持极高频率的HDR。详细的核染色方案以及我们验证过的编辑试剂的序列可以在上面找到我们的质粒的页面．我们鼓励任何进行基因组编辑实验的实验室尝试核染色，因为(在我们手中)这项技术支持的基因破坏或基因替换频率比转染方法大一个数量级。此外，试剂成本相对适中，需要表达Cas9蛋白、转录sgRNA和可选供体DNA。