该帖子于2018年3月21日更新。
大多数时候，质粒制备是轻而易举的事。你从Addgene那里得到你的刺，单菌落条纹，亚培养，并使用DNA准备工具包或您实验室的最爱进行准备内部协议. 该程序的DNA产量通常超过100 ng/ul，超过了足够的DNA产量验证你的质粒通过测序或限制性消化。
很有可能，你甚至会留下DNA用于其他应用，比如聚合酶链反应,克隆，转染或长期储存。但是，在那些令人讨厌的情况下，你的质粒产量是次优的呢？如果你总是从你的准备中得到次优的质粒产量，试试下面的提示！
如何优化你的质粒准备
我们将讨论以下提高质粒产量的技术。请记住，对于一个特别顽固的准备过程，您可能需要使用多种技术。- 检查菌种
- 增加音量
- 改进文化媒体
- 让它孵化
检查菌种
大肠杆菌宿主菌株之间的差异会影响质粒产量。检查细菌菌株，看看是否需要额外的步骤来优化产量。你可能想包括一个额外的清洗步骤或使用不同的菌株。
对于大多数应用，Addgene使用并推荐DH5!
由于其独特的特性，该菌株始终提供优质的PrePendA1recA1 relA1基因型，因为这些突变提高了质粒的稳定性和产量。
如果质粒易于重组
使用针对具有重复元件的质粒优化的菌株，例如具有反向末端重复的病毒质粒。我们使用NEB稳定型转化和制备含有这些元素的高质量DNA。
注意endA+菌株
像Stbl3已被设计用于减少质粒重组，但恩达+.恩达编码耐热周质内切酶这有时会与质粒DNA共同纯化，导致prep降解。许多质粒prep试剂盒建议执行额外的清洗步骤以去除内切酶（参见右图中的示例）。
注意碳水化合物
某些菌株，包括HB101及其衍生物，会释放大量碳水化合物，从而抑制细胞裂解过程。为了确保溶解完全，使用像Qiagen的LyseBlue这样的试剂，它使用颜色来显示溶解是否不完全。
蛋白质表达菌株不利于克隆
适于蛋白质纯化的菌株利用细胞资源生产高水平的蛋白质，而不是质粒DNA。如果你需要从一个蛋白表达菌株的质粒中提取大量的DNA，我们建议将质粒转化为用于DNA纯化的菌株。这听起来像是额外的工作，但从长远来看，这可能会节省时间!
虽然菌株的选择最终取决于质粒的特定特征，但建议检查质粒的基因型大肠杆菌以确保它适合您的应用。我们以前已经审查了许多普通实验室大肠杆菌博客上的压力，并推荐OpenWetWare提供的此便捷指南，以获得更多信息广泛列出常见问题大肠杆菌紧张.
增加音量
从较大的培养体积开始可以提高质粒产量。如果我们的质粒DNA产量不足，我们的实验室通常会将用于接种的培养物体积增加一倍。
为什么体积会有不同？用最简单的术语来说，体积越大=细胞越多=质粒越多。
质粒的拷贝数可能不同，即培养物中每个细菌细胞内支持的质粒拷贝数。拷贝数部分由质粒的复制的起源，但也会受到质粒大小、插入物性质、繁殖菌株、生长条件和接种材料的影响。更复杂的是，质粒拷贝数往往模棱两可，应该更多地作为指导，因为它们通常基于空质粒主干或重组质粒的拷贝数搜索者的个人观察。如果你正在经历一个拷贝数未知的质粒的低产量，完全有可能你正在使用一个低拷贝的质粒。
当增加培养体积时，请注意，当进行基于过滤器的质粒制备时，通过结合基质的更高体积的裂解物可能堵塞基质。一定要保持在推荐的过滤器范围内，否则你可能会无意中降低你纯化的DNA量！此外，如果如果已达到裂解液体积限制，则可通过添加培养基中加入氯霉素.
改进文化媒体
换一种更丰富的培养基或添加补充品可以提高你的细胞密度，从而提高质粒DNA的产量。培养条件对质粒DNA产量起着关键作用。不同的质粒和菌株在其最佳生长条件下会有所不同。对于许多高拷贝质粒，标准的LB肉汤和抗生素浓度都可以正常工作；然而，对于低拷贝质粒或生长较慢的菌株，改变培养基可能是有利的。
降低抗生素浓度
低拷贝质粒产生较少的抗生素耐药基因转录本，因此可以在含有一半正常基因的培养基中培养推荐的抗生素浓度。
向媒体添加补充内容
您可以使用营养丰富的肉汤（如极好的肉汤、2xYT）或针对质粒产量优化的自制啤酒来获得更高的细胞密度(e、 g.H15)。在培养基中添加镁盐、缓冲剂等补充剂和/或添加甘油或葡萄糖等额外碳源（适度）也可能有助于增加细胞密度和质粒产量。
从一个新的殖民地开始
直接从冷冻的甘油原液或琼脂刺进行亚培养可能会导致质粒丢失，而使用较旧的平板可能会增加质粒丢失或突变。
让它孵化
增加培养时间可以提高细胞密度，从而提高质粒产量。您可以优化您的生长时间、温度和摇动速度，以最大限度地提高细胞密度和质粒产量，因为这些因素通常是相关的，但不是完美的。
标准生长菌株中高拷贝质粒的典型生长时间为12-16小时，但具有低拷贝质粒的培养物可能需要生长20小时或更长时间才能达到最大质粒产量。每个质粒/菌株组合的最佳生长时间应根据确定细胞密度或在不同时间点采集和制备而单独确定。测量培养物的光密度可以指示给定体积中存在的细胞数量。
让氧气进来！
确保你的培养物获得了适合最佳生长的氧气量，因为气体交换不足会阻止你的培养物达到所需的密度。烧瓶或培养管的体积应至少是总培养体积的四倍，并且应确保摇瓶速度足够快，以便在隔夜培养中进行充分的气体交换。一般情况下，烧瓶中的大型培养物可在220 RPM左右摇动，但较小的培养物，尤其是深井培养板中的培养物，需要更快的摇动速度以实现适当的通气（260-300 RPM）。
37℃并不是对每个质粒都适用
某些质粒和菌株在标准37℃以外的温度下生长最好。该质粒特征应在制造商的质粒信息或生长菌株说明中注明。在Addgene质粒页面上，您可能会看到寄存者建议在30℃或室温。这些建议通常也需要较长的成长时间。
注：朱利安·泰勒·帕克为本文的写作做出了贡献。
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