光纳米体：利用光操纵细胞信号和蛋白质纯化

是时候选择你自己的蛋白质纯化冒险了。你想纯化你最喜欢的蛋白质（YFP）。您有两个选择：

选项1:亲和标签纯化

标记YFP并使用亲和柱进行纯化。将YFP与柱结合后，清洗数次以去除非特异性蛋白质，然后洗脱YFP。

选择2:光纳米体(optonb)净化

您可以跳过向YFP添加标记，而是使用optonb。你用OptoNB涂层珠填充一个柱子，并用蓝色LED灯包裹柱子。当你关掉灯，optonb结合YFP和非特异性蛋白质流动。为了洗脱YFP，你打开蓝色灯。

你选择哪个选项？

选择2可能听起来像是虚构的，但由于optonb，光控制的蛋白质纯化现在已经成为现实。最近由托特彻实验室， optonb是可光开关的工程纳米体它们的目标蛋白结合被蓝光照射改变。这种在对光反应中可逆结合和释放感兴趣的蛋白的能力允许无标记蛋白纯化以及细胞内内源性信号活性的可逆调节。

让我们来谈谈optonb的关键成分，它们是如何产生的，以及它们在蛋白质纯化和控制细胞信号转导方面的用途。

OptoNBs的关键部件

OPTONB有两个关键组件：一个AsLOV2域和一个nanobody。

• AsLOV2是来自oat工厂的一个轻氧电压传感域(燕麦属漂白亚麻纤维卷).在黑暗中，AsLOV2结构域以闭合构象折叠回自身，在蓝光下以开放构象折叠。
• 纳米体是一个小（~15kDa）单体可变重链抗体结构域。

这些组件是如何交互的?当融合在一起形成OptoNB时，AsLOV2结构域就像一个开关，使纳米体能够结合目标蛋白。

生成OptoNBs

AsLOV2结构域的开启和关闭变构性地改变了其纳米体伙伴的形状和结合能力，因此，将AsLOV2插入纳米体中的某个点保持AsLOV2和纳米体的活性非常重要。作为原理证明，Toettcher实验室监测AsLOV2插入到mCherry或GFP纳米体中如何影响其靶蛋白的结合。暴露在纳米体表面的环状结构似乎是放置AsLOV2的好地方，因为与插入蛋白质核心相比，在这里AsLOV2破坏纳米体功能的可能性更小。optonb还被贴上了红外荧光蛋白标签，这让研究小组可以检测到它与膜定位的mCherry或GFP蛋白的共同定位。在这个系统中，如果OptoNB可以结合，它就会与目标物在细胞膜上共同定位，当OptoNB不能结合时，它就会定位到细胞质上。

首先，研究小组将AsLOV2插入mCherry纳米体所有八个表面暴露环中的保守位点。只有插入环1和环6才能产生光控制结合，但效果相反：插入环1导致暗诱导结合，而插入环6导致蓝光诱导结合。实验室使用了这种通用的d设计方案以产生两个以上的光电二极管，一个反对mCherry还有一个反对绿色荧光蛋白。AsLOV2插入到环1中总是产生暗色诱导结合的optonb，但插入到环6中同时产生蓝光诱导和暗色诱导的optonb。下表总结了这些实验的结果。

表1:AsLOV2插入位点对光诱导结合影响的总结。

光控蛋白质纯化

OptoNBs的第一个应用程序需要我们体外:光控未修饰蛋白的亲和纯化。亲和纯化方法通常需要标记蛋白，这限制了这些方法用于重组蛋白。用轻按开关纯化未标记的蛋白质可以改善这一过程。

研究小组使用了镀镍琼脂糖珠，上面涂有他标记的optonb。然后，在暗光和蓝光之间循环时，对OptoNB涂层珠进行成像，显示出mCherry荧光在珠表面的蓝光依赖转移，表明OptoNB即使粘在珠表面时仍与目标蛋白结合。

使用OptoNBs控制细胞信号

OptoNBs的第二个应用将我们带入细胞：基于光的信号通路控制。这尤其令人兴奋，因为使用光来控制信号通路比药理学或基因操纵信号通路提供更高的时空分辨率。

作为原则证明，团队创建了一个控制Ras/Erk信号通路，由于参与细胞增殖和分化，在癌症中常被过度激活。

由于Ras是一种膜定位GTPase，研究小组将mCherry OptNb融合到Sevenless之子（SOS）的催化结构域，SOS是一种激活Ras的鸟嘌呤核苷酸交换因子。他们在表达膜定位mCherry的细胞中表达这种OptoNB-SOS融合蛋白。在黑暗中，SOS结合Ras并启动细胞外信号调节激酶（ERK）信号级联。这种信号很像电话游戏，直到信息到达细胞核，在那里基因表达的变化导致细胞增殖和分化。实验室通过使用一种新的方法证实了OptoNB SOS激活的Ras/Erk信号Erk激酶易位的荧光报告这些结果表明，optonB可用于调节信号通路，如Ras/Erk通路。

OptoNBs的下一步是什么？

虽然OptoNB照亮了一条光控制蛋白质结合的道路，但它们可能还没有结合你最喜欢的蛋白质。更多的OptoNB将允许更多的蛋白质被无标记纯化。更多的结合细胞信号受体的OptoNB将提供更多的杠杆来拉动控制信号通路。例如，如果OptoNB可以结合和聚集k受体或配体的活性，然后轻开关的翻转可以控制信号通路。最终，开发更多的OPTONB将允许细胞内外的更多用途。

工具书类

吉尔，阿格涅斯卡，等人。”利用光开关纳米体对蛋白质结合的光遗传控制."BioRxiv(2019): 739201.

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