而慢病毒载体188完整比分直播是流行的基因传递工具，生产慢病毒，可能会带来一些挑战。是否选择了最适合实验的系统，试图产生一种可用的病毒效价，或微调选择和表达的目标细胞系，研究人员经常发现自己面临的障碍。在这篇文章中，我们将概述一些与生产和使用慢病毒相关的常见挑战，并提供一些克服这些障碍的技巧和技巧。
谈论我的慢病毒一代
通过慢病毒传递基因的第一步是决定什么样的包装系统最适合特定的实验。新一代慢病毒包装系统旨在防止复制能力慢病毒（RCL）的形成。复制能力可能来自病毒生产过程中的重组事件，并对用户构成生物安全风险。为了降低此类事件的风险，新的慢病毒包装系统将病毒成分分为多个质粒。第二代包装系统使用3种质粒；通常编码VSV-G的包膜质粒、含有结构基因的包装质粒和携带转移基因的转移质粒。通过将病毒成分分成多个质粒，重组的风险以及由此产生的RCL大大降低。第三代包装系统通过从包装质粒中去除病毒Rev基因并将其整合到第四个质粒中，进一步拆分病毒基因组。此外，5'长末端重复序列（LTR）的启动子在第三代系统中发生突变，因此它不再需要病毒反式激活子Tat。有关不同代慢病毒包装系统的更多信息，请参阅Addgene's慢病毒指南．
虽然第三代包装系统提供了额外的安全水平，他们也需要第四个质粒。对额外DNA的要求会影响包装细胞系的转染效率，从而影响病毒的滴度。额外的质粒也会影响实验的优化。在开始实验之前，建议您尝试几种不同比例的转移质粒、包膜质粒和包装质粒，以获得最佳滴度。需要额外的质粒进行转染会使这些优化实验更具挑战性。考虑到这些因素，在计划实验时，用户应该权衡提高生物安全性的好处与潜在的效价;在选择正确的系统时，最终用户的BL2经验水平、转基因的大小和下游应用都应该考虑。
最近,第四代包装系统已通过Clontech提供。该系统通过将病毒基因组分割成额外的质粒，从而增加产生RCL所需的重组事件的数量，从而提高安全性。为了克服第三代包装系统的滴度障碍，该系统结合了Tet-off转录激活系统，以驱动某些病毒成分的高水平表达；根据制造商的说法，这些变化导致产量比其他可用系统高出25倍。
产生慢病毒：这都是关于T的（转染和滴度）
为了产生慢病毒，编码结构元件、包膜和转移基因的质粒被转染到包装细胞系中，通常是293T的衍生物。培养包装细胞，几天后收集、过滤和滴度上清液。获得可用慢病毒的一个主要障碍是为你的实验产生足够高的浓度或滴度。为了提高滴度，首先优化转染条件。如上所述，质粒比率可以调整以提高滴度。此外，转染方法（即聚乙烯亚胺、磷酸钙或脂质体方法）、反应量、收获时间和数量都会影响滴度。重要的是，一个转移质粒的优化条件并不总是对其他质粒的最佳条件。例如，在我们的手中，我们发现48小时和72小时的双收获方法为带有小插入物的转移质粒（如CRISPR导向物）产生高滴度病毒，而单个72小时收获对较大的基因（如Cas9）最好。如图1所示，改变转染率如何影响转染效率。
对于某些转基因而言，单纯的转染优化不足以获得足够的效价;这通常是大基因的情况。这是由于大型插入件的低效包装;一项研究Kumar等人发现，在某些情况下，插入大小每增加2kb，滴度就会下降10倍。为了克服这一问题，慢病毒可以通过多种方法浓缩，如超离心法、上离心法等蔗糖梯度，旋转柱，聚乙二醇(PEG)沉淀。所有这些方法最终隔离了病毒颗粒，使你可以集中在更小的体积。因此，你最终得到的体积比未浓缩的要小得多。例如，在Addgene，我们通常浓缩100倍，也就是10厘米2病毒培养皿制备只能产生150 μl的物质，而非从未浓缩的培养皿中收集的15 ml物质。
考虑到这一点，如果实验需要一定体积的病毒，考虑通过增加10厘米数量来扩大规模2或增加容器的大小。选择更大的容器，如3层或5层烧瓶，需要进行一些初始优化；在开始之前，需要优化细胞数量、培养基体积和质粒浓度。我们建议计算较大血管的表面积与10 cm的比值2培养并调整细胞数量、质粒浓度和实验体积。虽然你可能需要做一些最后的调整，但这通常是一个很好的开始。如果您没有预料到您将需要大量的慢病毒常规，您可以选择简单地增加10厘米的数量2菜。虽然此选项很有吸引力，因为对于单个10 cm2一道菜可以很容易地用于多个菜，记住，处理多个菜需要更长的时间，可能会增加出错或污染的风险。
最后，浓缩方法的选择取决于各种因素，如可用资源、成本和下游应用。例如，虽然PEG沉淀法相对便宜且不需要超离心机，但PEG将沉淀溶液中的所有蛋白质，而不仅仅是慢病毒；因此，当下游需要纯病毒时，这可能不是最好的方法。
在评估慢病毒滴度时，不要将苹果和橘子进行比较
在选择包装系统和生产慢病毒后，是时候滴度。在滴度慢病毒时，一个重要的考虑因素是用于滴度的细胞系。通常，研究人员会选择一个相对宽容的细胞系进行滴度，以获得可能的最佳滴度。虽然这个信息提供了一个很好的起点，但它可能不能转化为目标细胞系。为了克服这个问题，我们建议在转导靶细胞系时使用不同剂量的慢病毒。还应考虑滴度转导实验的具体情况。培养基选择、反应容器、病毒剂量、体积和转导时间都将影响记录的滴度，在转导靶细胞系时应加以考虑。有关慢病毒滴度的更多提示，请参阅我们的博客．
在选择最佳的慢病毒系统、产生可接受滴度的病毒和成功转导感兴趣的细胞系之间，很多事情都可能出错。我们希望我们已经为你提供了一些想法，如果你确实遇到了障碍，鼓励你检查慢病毒协议和博客文章在Addgene的网站上获取更多资源。
参考文献
慢病毒载体包装限度的系统测定。188完整比分直播(12)(15): 193 -905。PubMedPMID: 11589831．
姜伟等。。无需超速离心的高滴度慢病毒制剂的优化方法。Sci Rep.2015；5:13875. PubMedPMID:26348152．公共医学中心PMCID: PMC4562269．
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