本文由客座博主Alan Wong贡献。
生物系统的复杂性可能会阻碍我们研究和设计它们的尝试，但如果我们有一个简单的工具，让我们能够快速解码复杂性呢康比格姆克里斯普酒店该技术的目标是提供一个易于使用的工具，以可扩展的方式分析您最喜欢的生物表型背后的复杂组合遗传网络。这篇博文将向你介绍这项新技术，并引导你了解CombiGEM-CRISPR实验的基础知识。
CombiGEM-CRISPR:两个简单平台的结合
克里斯普已经彻底改变了我们解码基因组的方式，使其更容易产生特定的遗传扰动。设计和合成用于大规模基因组编辑的CRISPR引导rna (gRNAs)的简单性导致了全基因组gRNA文库的快速生成，这些文库可以敲除(Doench等人，2016年；哈特等人，2015年；Koike Yusa等人，2014年；马等人，2015年；Shalem等人，2014年；Wang et al.， 2014)，击倒(Gilbert等人，2014年)，并激活(Gilbert等人，2014年；科内曼等人，2014年)个体基因，以研究其功能。不断gRNA设计的进展实现最大的目标和最小的脱靶活动的必要条件已经证明，它们对于单个细胞中个体(和多个)遗传扰动的有效生成是非常有用的。放大多通道CRISPR系统用于高通量筛选的方法对于绘制生物系统复杂调控基础上的组合遗传学非常有用。
CombiGEM平台提供了一种创建条形码gRNA文库的方法，该文库可用于组合修改基因组，筛选特定表型，并快速分析结果命中率(Cheng et al.， 2014；Wong等人，2015年；Wong等人，2016年).CombiGEM使用迭代的一锅式反应，简单明了限制消化和结扎构建含有一个或多个grna的条形码慢病毒质粒的步骤。由于每个连接反应使用一个gRNAs库作为起始材料，连接产物是一个多样化的慢病毒质粒库。经过多轮的消化和连接，每个质粒中都含有不同gRNAs的组合。每个gRNA组合都可以通过测序其条形码来跟踪和定量分析。CombiGEM是高度灵活的，可以容纳任何感兴趣的遗传元素。因此，它可以针对用户的具体研究问题进行定制。CombiGEM已成功应用于功能表征通过多重gRNA表达产生的组合基因敲除(Wong等人，2016年)，以及包括转录因子在内的其他遗传因子的组合表达(Cheng et al.， 2014)和microRNA(Wong等人，2015年).
开始你的CombiGEM CRISPR实验
你需要做的第一件事是获得针对你感兴趣的基因的有效gRNA序列列表。由于各研究团队为建立和不断改进gRNA库所做的巨大努力，具有有效gRNA的优秀资源已公开，包括在Addgene发现的那些！
有了gRNA的目标序列列表，你就可以很容易地通过oligo合成生成你的条形码gRNA库序列，使用下面所示的格式，并池克隆它们到pAWp28存储向量(图1):
前低:5 ' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTGGGTCTTCGAGAAGACCTATTCXXXXXXXXC-3'；
反向低聚物：5'-AATTGXXXXXXXXgaataggtctcgaagcccaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'，
在哪里NNN和XXX分别为20 bp的gRNA靶序列和8 bp的gRNA条形码。
一旦克隆到存储载体中，汇集的、条形码的gRNA文库现在可以用于基于CombiGEM的组装到CombiGEM慢病毒载体主干中爪12（图2).从pAWp28存储载体克隆到pAWp12慢病毒载体应保留gRNA文库中的多样性，但在开始实验之前，应通过NGS进行验证。
随着CombiGEM和CRISPR平台的集成，我们期待着在功能基因组学、细胞重编程等领域实现各种干扰和应用。有关更多详细信息，请访问Wong等人2016和Wong等人2015．
黄志光现任香港大学生物医学学院助理教授。他对开发和应用新技术来询问和理解复杂的生物系统特别感兴趣。可以通过aslw@hku.hk．
工具书类
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参考资料在Addgene博客188博金宝官网
Addgene.org上的资源
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