随着时间的推移质粒使学生参与功能基因组学研究

这篇文章是由波士顿学院副教授Clare O'Connor撰写的。

国家报告强调向本科生提供真实的研究经验的重要性(1，2)，但教育工作者在设计合适的项目方面面临重大挑战。在奥康纳实验室，我们认识到基因组测序项目产生了大量的数据，这些数据可以为学生的入门实验室项目提供基础。基因组计划使用计算方法根据基因与其他物种基因的相似性来识别基因，但这些研究通常留下关于基因功能的问题。如果两个看似相似的蛋白质由于长期积累的突变而获得了不同的功能，会怎么样呢?大学生可以帮忙回答这个问题!

路径随时间推移项目

“时间之路”项目为这些本科生研究问题提供了一个框架。这个想法很简单。教师首先选择一个多基因途径进行研究，并选择一个有缺失菌株的参考生物。然后，工作人员或学生从一个研究不那么充分的生物体克隆类似的序列到过表达质粒。接下来，学生们用过表达质粒从参考生物中转化缺失菌株。最后，学生确定质粒的存在是否纠正了由于缺失而导致的任何已知表型异常(即质粒补充缺失)。如果表型被纠正，学生可以相对确信测试物种的基因与参考物种的基因具有相似的功能。

我们一直使用酵母模型(3.，4)，以回答有关蛋氨酸合成相关基因进化的问题(5）.出芽酵母,酿酒。酵母由于它是非致病性的、经过充分研究且价格低廉，因此是本项目的一个很好的参考生物。此外，一套完整的注释良好的删除菌株可用(6）.甲硫氨酸合成酿酒酵母在他们的实验中，学生们测试来自裂变酵母的蛋白质，粟酒裂殖酵母，具有相同的功能酿酒酵母．这两种酵母被认为起源于3.5亿年前的共同祖先。随着时间的推移，由于整个基因组的复制和广泛的重排，这两个基因组变得非常不同酿酒酵母血统(7）.

在我们的课堂研究项目中，学生进行了转化酿酒酵母见过带有过表达质粒的缺失株满足/见过基因从美国非洲酒或酿酒酵母．然后学生确定质粒的表达是否编码见过基因允许转化的菌株在没有蛋氨酸的情况下生长(即质粒弥补缺失)。

在这里找到质粒

质粒特性使学生能够进行多次实验

我们使用威尼斯平底渔船克隆插入十个不同的编码序列满足/见过基因(图1)从两个酵母物种pYES2.1/V5-His酵母过表达载体．这个质粒包含复制的起源和可选择的标记，允许学生在E。杆菌（让奥和amp^R)或酿酒酵母（2µm·奥利和URA3）.的存在URA3基因允许学生选择已经成功转化了质粒的酵母，因为酿酒酵母删除菌株是∆ura3突变体，不补充尿嘧啶就无法生长(6)满足/见过来自pYES2.1质粒的基因受GAL1启动子。克隆过程同时添加V5和His₆表位标记到Met蛋白的c端，在其他实验中可以通过western blotting来确认蛋白的表达(图2)。

互补揭示了函数的守恒

学生们使用这些质粒，这些质粒已经与Addgene一起储存，成功地分析了Met蛋白的互补。在图3所示的过程中，学生首先转换酿酒酵母见过缺失菌株，然后在缺乏尿嘧啶但含有蛋氨酸的培养基上分离转化菌株。(这使得细胞既可以携带功能性细胞，也可以携带非功能性细胞见过基因生长。)然后学生用复制电镀来确定是否表达满足/见过来自质粒的基因允许转化的菌株在缺乏蛋氨酸的情况下生长。自GAL1启动子控制满足/见过基因表达时，只有当半乳糖取代葡萄糖作为碳源时才会发生互补。学生的成绩表明，大多数，但不是全部，美国非洲酒了基因补充相应的酿酒酵母见面缺陷(手稿准备中)，表明Met蛋白的功能在物种分化后得到了很大程度的保留。

关于使用时间路径质粒的提示

这些质粒是波士顿学院一学期的研究课程的一部分，这也是生物学核心课程的一部分。该课程的学生以三人小组的形式进行工作，每组15名学生。在每个部分中,团队分配不同组的三个基因从遇到的不同部位选择途径(图1)。除了互补实验,用来回答研究问题,质粒也用来教学生关于限制映射和免疫印迹。参加课程的学生在内容知识和研究技能方面都有显著提高(8）.一套完整的学生和教师资源可在我们分子细胞生物学网站调查．

非常感谢我们的客座博主克莱尔·奥康纳!

克莱尔·奥康纳(左，实验室主任道格·华纳右)曾在波士顿学院教授生物化学、分子细胞生物学和遗传学课程。她对将研究纳入本科课程和向公众传播科学的策略特别感兴趣。你可以找到更多关于克莱尔在生物系网站．

参考文献

1.美国科学促进协会。(2011)。本科生物学教育的视野与转变:行动的呼唤,华盛顿特区。

2.总统科学技术顾问委员会(PCAST)(2012)。追求卓越:培养100万拥有科学、技术、工程和数学学位的大学毕业生华盛顿特区:美国政府科学技术办公室。

3.杜娜，A. A.，米勒，m.e.，和基尼，J.B.芽殖酵母为芽殖遗传学家:一个引物酿酒酵母模型系统。遗传学19733-48(2014)。PubMedPMID: 24807111．公共医学中心PMCID:PMC4012490．

4.一种古老的酵母，为年轻的遗传学家:入门粟酒裂殖酵母模型系统。遗传学201, 402 - 423。(2015)．PubMedPMID: 26447128．公共医学中心PMCIDPMC4596657．

5.陈志强，陈志强，陈志强，等。含硫氨基酸代谢的研究进展酿酒酵母．Microbiol杂志牧师61, 503 - 532。(1997)。PubMedPMID: 9409150．公共医学中心PMCIDPMC232622．

6.Winzeler, D.A, Shoemaker, D.D, Astromoff, A.， Liang, H.， Anderson, K.， Andre, B.， Bnangham, R.， Benito, R.， Boeke, j.d.， Bussey, H.。et al。的功能表征酿酒酵母基因组的基因缺失和平行分析。科学285, 901 - 906。(1999)。PubMedPMID: 10436161．

7.酵母进化基因组学。Nat牧师麝猫11, 512 - 524。（2010）.PubMedPMID: 20559329．

8.Reeves, t.d.， Warner, d.m.， Ludlow, l.h.， & O’connor, c.m。pathway over time: Functional genomics research in a introduction laboratory course。CBE-Life科学。建造。17, ar1。(2018)。PMID: 29326101．

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