pCXLE工具包:基于episomal质粒的将外周血细胞重编程为ips细胞的有效方法

本文由麻省总医院博士后Kusumika (Kushi) Mukherjee撰稿。

十多年前实验:和同事报告说，通过添加重新编程(或“山中”)因素他们改变了再生医学的面貌。他们的工作为诱导多能干细胞的临床和治疗应用开辟了广阔的可能性。人类iPSCs (hiPSCs)的产生现在提供了一个机会来开发和使用患者特异性体细胞，否则很难获得。这些可以用来进行细胞治疗和模拟疾病在体外．

在Addgene找到干细胞质粒

从成纤维细胞和角质形成细胞到外周血单个核细胞(PBMCs)，许多来源的成体体细胞已经被探索在iPSC编程中的适用性。全血分离的pbmc对诱导多能干细胞的产生有很多好处:

1. 与收集成纤维细胞的过程相比，从患者身上抽取血液更容易，也更常规，后者需要更有侵入性的皮肤活检程序。当招募患者，特别是儿童和皮肤疾病患者进行研究和临床试验时，这是一个主要的好处，因为它允许有更多的自愿参与者。
2. 虽然从老年患者获得的成纤维细胞重组效率较低，但在获得血液的患者的年龄和随后的重组成功之间没有发现这种相关性[1］．
3. 成纤维细胞需要培养和扩增在体外从血液中收集的pbmc在收集后立即进行重编程[2］．
4. 与年龄匹配的成纤维细胞相比，pbmc显示出独特的表观遗传特征，更接近hiPSCs [3.］．

这些优点使pbmc成为用于重编程目的的理想的体细胞来源。在这篇文章中，我将描述一种episomal载体系统，它通过表达针对p53、一种改良的重编程因子鸡尾酒和病毒蛋白EBNA-1的shRNA来提高重编程效率。

从pbmc重新编程hiPSCs的方法

虽然重编程的方法选择往往取决于体细胞的来源，但所有重编程方法的共同目标是重编程因子OCT3/4、SOX2、KLF4和C-MYC[1]的表达。对于临床级hiPSCs的衍生，不涉及通过整合病毒载体修改原始基因组的重编程方法是首选。188完整比分直播这是为了避免插入突变的机会，插入突变是指转基因整合到基因组中，可能导致插入位点功能基因的破坏，并可能促进肿瘤的发生在活的有机体内．这种现象在过去的基因治疗试验中有记录，在临床领域仍然是一个安全问题[4］．在为临床目的生成hiPSCs时，考虑了三种主要的重编程方法:

1. mRNA转染-这允许重编程因子的瞬时表达
2. 仙台病毒——一种非整合RNA病毒
3. 偶质载体-染色体外维持的表达重编程因子的DNA质粒

到目前为止，mRNA转染方法尚未成功用于从PBMCs获得ips细胞。大多数实验室使用仙台病毒有效地重新编程pbmc [5］．然而，仙台病毒方法是昂贵的，特别是如果用于临床级hiPSCs。例如,CytoTune™-iPS 2.1仙台重编程试剂盒用于产生临床级hiPSCs，在ThermoFisher Scientific公司售价1.1万美元，仅可用于6-8次重编程反应。使用仙台病毒的另一个缺点是残留病毒物质的持久性[6］．完全清除残留的病毒颗粒和建立无病毒的hiPSCs通常需要5-10代。此外，与仙台病毒合作需要采取严格的生物安全措施，从而增加了程序的成本。Episomal重编程是创建临床级、安全、非病毒和非整合hiPSCs的理想和经济的方法，其中编码重编程因子的载体在靶细胞的细胞核中作为单独的染色体外元素。该方法还减少了在生产和使用仙台病毒时涉及的生物安全问题。

具有偶集向量的pbmc的重编程效率

Episomal载体基于Epstein-Barr核抗原-1 (OriP -EBNA-1)系统，其中每个载体包含一个DNA复制的病毒来源，OriP和为DNA结合蛋白EBNA-1编码的EBNA-1序列[7］．这两个序列对于载体在人类细胞中的保留和复制是必要和充分的[8］．EBNA-1蛋白识别OriP，并诱导宿主细胞中DNA扩增的同时片段扩增。这使得重编程因子的表达相对高且长期。然而，episoms载体对pbmc的重编程效率很低(0.001-0.03%)[3，9］．2011年，Chou等人生成了两个向量的混合物，编码了6个因子-OCT3/4，SOX2，KLF4，原癌基因，LIN28SV40大T抗原(SV40LT)．以pbmc作为体细胞来源时，该方法的重编程效率仅为0.001%。这意味着每100毫升初始血液样本中只有16个hiPSC菌落，在最好的情况下为[7]。在患者血液样本有限的临床环境中，这种低效率的重编程是使用pbmc作为重编程体细胞来源的主要障碍。

提高PBMC重编程效率:pCXLE episomal矢量工具包

先前的研究表明，TP53的抑制和替换可以增强iPSC的生成原癌基因与L-MYC［10，11］．虽然这两种因素促进iPSC生成的机制尚不完全清楚，但添加P53的shRNA并替换iPSC原癌基因与L-MYC在Okita等人的episomal重编程鸡尾酒中增加了pbmc的重编程效率[7]。该小组生成的pCXLE偶粒载体系统是由编码重编程因子的三个偶粒(表1)优化组合而成的。偶体载体通过电穿孔导入细胞。电穿孔后10天获得hiPSC菌落，多数无整合，染色体正常，能分化为三胚层[7]的各种细胞类型。

为了进一步提高重组效率，在重组鸡尾酒中使用了一个额外的质粒pCXWB-EBNA-1。pCXWB-EBNA-1缺乏oriP，无法在人类细胞中复制，因此暂时表达额外的EBNA-1。瞬时表达的EBNA-1增加了来自其他异质粒的蛋白表达。当在pbmc上使用时，pCXLE偶量矢量系统将重编程效率从0.001%提高到近0.1%[7]。就hiPSC菌落而言，现在仅从1毫升的外周血中就可以获得近16个hiPSC菌落，这是以前报道的一个巨大进步。因此，pCXLE episomal系统提供了一种实用的方法，从易于获取的患者血液样本中生成无转基因、无病毒的临床级hiPSCs。表1中列出的所有pCXLE载体在Addgene均有。

表1:pCXLE偶体质粒清单，它们的Addgene ID号和它们编码的重编程因子

非常感谢我们的客座博主Kusumika (Kushi) Mukherjee。

Kusumika (Kushi) Mukherjee目前是麻省总医院的博士后研究员，在基因编辑和干细胞领域有研究兴趣。在LinkedIn @上和她联系https://www.linkedin.com/in/kmukherjeephd /．

参考文献

1.埃尔·霍卡耶姆，吉米，霍利·n·库基尔，德里克·m·戴克霍恩。“血液衍生的诱导多能干细胞(iPSCs):利益、挑战和前方的路”。阿尔茨海默病与帕金森病杂志6.5(2016)。PubMedPMID: 27882265．公共医学中心PMCID: PMC5118044．

2.Kim, Y.， et al.， Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of reprogramming Cells by离心。干细胞国际，2016。2016: p。1329459。PubMedPMID: 27579041．公共医学中心PMCID: PMC4989082．

3.Chou, B.K, et al.，通过血细胞中具有独特表观遗传和基因表达特征的非整合质粒获得高效的人类iPS细胞。细胞Res, 2011。21(3): 518 - 29页。PubMedPMID: 21243013．公共医学中心PMCID: PMC3193421．

4.hacein - bayy - abina, S.等，2例患者在接受SCID-X1基因治疗后lmo2相关克隆T细胞增殖。科学,2003。302(5644): 415 - 9页。PubMedPMID: 14564000．

5.Seki, T.， S. Yuasa, K. Fukuda，使用活化T细胞和仙台病毒的组合，从少量人类外周血中产生诱导多能干细胞。Nat Protoc, 2012年。7(4): 718 - 28页。PubMedPMID: 22422317．

6.诱导多能干细胞的最新技术进展和临床应用。韩国J实习医生，2014年。29(5): 547 - 57页。PubMedPMID: 25228828．

7.从脐带血和外周血细胞中生成无整合的人诱导多能干细胞的一种有效的非病毒方法。干细胞,2013。31(3): 458 - 66页。PubMedPMID: 23193063．

8.Ehrhardt等，Episomal载体用于基因治疗。Curr Gene Ther, 2008。8(3): 147 - 61页。PubMedPMID: 18537590．

9.Mack, a.a.，等，从非整合的episoms载体的多个供者血液中提取的CD34+细胞诱导多能干细胞的生成。《公共科学图书馆•综合》,2011年版。6(11): p . e27956。PubMedPMID: 22132178．公共医学中心PMCID: PMC3222670．

10.洪，等，通过p53-p21途径抑制诱导多能干细胞生成。自然,2009年。460(7259): 1132 - 5页。PubMedPMID: 19668191．公共医学中心PMCID: PMC2917235．

11.中川，M.等，转化缺陷Myc促进直接重编程。美国国立科学院科学研究所，2010。107(32): 14152 - 7页。PubMedPMID: 20660764．公共医学中心PMCID: PMC2922531．

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