Addgene很自豪地宣布，我们最近获得了分销能力piggyBac转座子的质粒．这些质粒，当结合piggyBac™转座酶的来源(可从转座或许可经销商）允许您快速将DNA序列从转座子载体转移到分布在整个基因组中的许多TTAA序列之一。我们鼓励你储存piggyBac™转座子载体帮助我们扩展这一有用的资源。而Addgene不能用piggyBac分配质粒™ Transpose本身，请继续阅读，从Transposage的员工那里了解更多关于这项激动人心的技术的信息。
这篇文章由Transposagen公司的Amar Singh和Mathew Goodwin贡献
piggyBac转座子是什么?
小猪™ 转座子最初于1983年在蛾类中被发现，但直到2005年才成功用于哺乳动物细胞的基因操作[1.]．与其他转座子一样，piggyBac™有两个组成部分，a转座子与转座酶. 小猪™ 转座酶促进了转座子在基因组中随机分布的“TTAA”位点的整合。基因组中“TTAA”的预测频率为每256个碱基对DNA序列中1个，这对于基因工程方法非常有用。然而，对于这项技术来说，最重要的是转座酶还能够以完全无缝的方式切除转座子，不留下任何序列或突变。此外，piggyBac™ 提供大的货物承载能力（已证明超过200 kb），没有已知的上限[1.]．piggyBac™技术可用于多种应用，包括转基因、基因陷阱筛选和基因编辑。
小猪是怎么吃的™ 系统使转基因细胞系的产生变得更容易？
piggyBac的主要用途之一™ 该系统旨在建立稳定的转基因细胞系。建立稳定细胞系的传统方法是转染、选择和分离克隆。这一过程既繁琐又低效，因为它依赖于相关细胞系中可能较低的随机整合效率。小猪™ 该系统允许通过转染显著提高随机整合效率，因此无病毒。这是使用piggyBac实现的™ 转座酶，促进供体转座子（携带你感兴趣的货物）直接整合到整个基因组的随机“TTAA”位点。使用piggyBac时™, 货物完全完整地插入基因组，而通过标准DNA质粒转染，货物中可能出现双链断裂。此外，使用piggyBac™, 通过滴定转座酶与转座子的比率，可以严格控制整合拷贝数。转座酶与转座子的高比率导致每个细胞中有更多的整合，并且super-piggyBac商标可用于获得更多的集成.但应注意的是，piggyBac™ 整合效率可能取决于细胞系，并且应该在感兴趣的细胞系中进行测试。重要的是，通过改变这些比率，您可以根据需要最大化或最小化感兴趣基因的表达水平。当所表达的基因具有hreshold效应，如信号分子或转录因子，或当基因具有组成性活性或显性阴性突变体时。减少拷贝数也可以减轻某些基因表达的有害影响，如对适应性有负面影响的基因。
用piggyBac构建转基因细胞系时的一个考虑因素™ 系统是，它有一个开放染色质区域的整合偏好，特别是在启动子或外显子区域。如果细胞的染色质结构经历了重大的重排（例如干细胞开始分化时），转基因沉默可能会发生（就像任何整合的转基因一样）。为了克服这一障碍，可以加入阳性选择盒，并在分化过程中使用。此外，一个splinkerette-PCR化验可用于绘制整合的特定遗传位点[8.]．
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图1：piggyBac的机理™ 转座酶/转座子基因修饰系统和无疤痕、无足迹™ 仅使用piggyBac移除货物™ 转座。转座者提供的图像。 |
piggyBac是怎么做的™ 加强基因编辑？
由于位点特异性核酸酶的发展(CRISPR/Cas9,距骨,锌指核酸酶)然而，仍然存在一些挑战，例如使基因编辑完全无缝（即，没有发生其他基因改变）和分离具有所需编辑的特定细胞。幸运的是，通过将核酸酶技术与piggyBac相结合™ 在系统中，这些挑战可以大大减少。
小猪™ 转座子系统可以与CRISPR/Cas9结合，在动物模型或细胞系（包括干细胞）中有效地执行遗传操作，而不留下任何辅助DNA序列[2.]， [3.].简单地说，就是猪巴™ 包含选择标记的转座子包含在标准中同源定向修复模板，以方便选择包含所需编辑的单元格。然后使用piggyBac转座酶无缝移除选择标记。这可以通过在携带感兴趣的DNA编辑的供体质粒中利用piggyBac™转座子和位点特异性核酸酶(如CRISPR/Cas9)创建双链DNA断裂来实现。在DNA切割后，piggyBac™供体被细胞的宿主机器使用，通过同源重组进行DNA修复，这导致将你的特定编辑合并到宿主基因组中。通过使用只切除的piggyBac转座酶(PBx)，其中包含突变，使其能够切除，但集成缺陷[4.，则移除供体盒，不留下附属转座子序列。PBx的使用尤其重要，以避免piggyBac™供体的任何可能的随机重新整合，这通常与野生型piggyBac™转位酶发现[4.].通过使用含有负选择标记（如胸腺嘧啶核苷激酶）的供体质粒，研究人员可随后杀死经PBx切除后仍含有供体质粒的任何细胞，从而只留下无足迹的细胞™ 基因组编辑。
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图2：使用piggyBac编辑DNA™ 利用位点特异性核酸酶刺激同源重组和无足迹的转座子选择技术™ 仅通过切除piggyBac移除选择盒™. 图片由Transposagen提供。 |
小猪是怎么吃的™ 基因编辑系统与其他基因编辑方法比较？
主要有两种通过基因编辑产生特定点突变的其他方法。第一，代替使用piggyBac™, 你可以使用重组酶技术(Cre / loxP)取出供体盒。虽然这种方法可能是有效的，但在去除供体后，loxP位点会留在基因组中，这会改变内源性DNA序列，并被认为会导致细胞毒性[5.]第二，你可以使用单链寡核苷酸（ssODN）作为供体，而不是使用供体质粒[6.]这种方法的问题是，由于没有选择，您需要筛选介于100到1000个克隆之间的某个地方，以找到具有感兴趣编辑的细胞系。用更大的piggyBac™ 供体载体，可以使ITR和选择盒破坏核酸酶的靶位点，从而防止再切割。转座酶移除暗盒后恢复目标序列。这使得研究人员可以避免像SSODN那样进行不必要的碱基对更改。
使用PBx进行切除的一个小缺点是它的效率。而PBx切除的效率已被证明高于野生型piggyBac™ 转座酶或过度活跃转座酶突变体[7.]但是，使用阴性选择在很大程度上克服了这一障碍。此外，我们发现，在某些细胞系中，PBx mRNA转染比质粒转染效率更高，这很可能是由于DNA毒性。更重要的是，与Cre重组酶不同，PBx的效率更高这是一个非常具体的问题，尚未向客户展示表达时引起基因组异常. 这种缺乏脱靶效应可能是由于PBx依赖于在piggyBac上发现的反向终端重复序列（ITR）™ 捐助者对其活动表示感谢。
总而言之，piggyBac™转座子是一项强大的技术，可用于各种研究应用，包括制造转基因细胞系和转基因细胞系。此外，piggyBac™基因编辑的使用使您可以有效地执行无缝的基因操作，同时避免其他方法常见的缺陷。
非常感谢我们的客座博客阿玛尔·辛格和马修·古德温转座!
阿马尔·辛格博士是Transposagen的资深科学家。他对分子和细胞生物学有着长期的兴趣，并为Transposagen的细胞工程团队带来了10年的干细胞研究经验。
马修·古德温(Mathew Goodwin)是Transposagen公司的技术销售专员。作为一名基因编辑爱好者，他花了6年多的时间在实验室开发和使用各种基因编辑技术，包括锌指、TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶。马修运用他的专业知识帮助研究人员为他们的项目确定正确的技术和策略。
工具书类
1.L.E.Woodard和M.H.Wilson，“背驮模型和新的治疗策略。”生物技术趋势。，第33卷，第9期，第525-332015年9月。PubMedPMID:26211958. PubMed Central PMCID：PMC4663986。
2.A. M. Singh, V. V Adjan Steffey, T. Yeshi, D. W. Allison，《人类多能干细胞的基因编辑:选择正确的路径》，干细胞再生。比尔。， vol. 1, no. 11、1月PubMedPMID:26702451公共医疗中心PMCID：PMC4686154．
3.A.M.Singh、D.W.Perry、V.V.A.Steffey、K.Miller和D.W.Allison，“利用无缝基因编辑解码人类多能干细胞的表观遗传异质性。”方法采用分子生物学方法。2016年4月，PubMedPMID:27075976．
4.X. Li, E. R. Burnight, A. L. Cooney, N. Malani, T. Brady, J. D. Sander, J. Staber, S. J. Wheelan, J. K. jong, P. B. McCray, F. D. Bushman, P. L. Sinn, and N. L. Craig，《基因工程piggyBac转座酶工具》，Proc。国家的。学会科学。美国的一个。，第110卷，第25期，第E2279-87页，2013年6月出版PMID:23723351公共医疗中心PMCID：PMC3690869．
5.D.Grégoire和M.Kmita，“倒置loxP位点之间的重组对增殖细胞具有细胞毒性，为条件性细胞消融提供了一个简单的工具。”Proc。国家的。学会科学。美国的一个。，第105卷，第38号，第14492-6页，2008年9月，PubMedPMID:18787116公共医疗中心PMCID：PMC2567143．
6.S.Radecke，F.Radecke，T.Cathomen和K.Schwarz，“锌指核酸酶诱导的寡核苷酸基因修复：需要和不需要的靶位点修饰。”摩尔瑟。，第18卷，第4期，第743-53页，2010年4月。PubMedPMID:20068556公共医疗中心PMCID：PMC2862519．
7.A. L. Firth, T. Menon, G. S. Parker, S. J. Qualls, B. M. Lewis, E. Ke, C. T. Dargitz, R. Wright, A. Khanna, F. H. Gage, I. M. Verma，“患者诱导多能干细胞产生的肺上皮细胞囊性纤维化的功能基因校正。”细胞代表。，第12卷，第9期，第1385-902015年8月出版PMID:26299960公共医疗中心PMCID：PMC4559351．
8.A.G.Uren、H.Mikkers、J.Kool、L.van der Weyden、A.H.Lund、C.H.Wilson、R.Rance、J.Jonkers、M.van Lohuizen、A.Berns和D.J.Adams，“用于分离和测序逆转录病毒插入位点的高通量Sprinkerette PCR方法。”Protoc Nat。，第4卷，第5期，第789-98页，2009年1月。PubMedPMID:19528954公共医疗中心PMCID：PMC3627465．
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话题：CRISPR,其他CRISPR工具
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