如果你关注CRISPR的研究，你就会知道如何使用异源end-joining (NHEJ)删除或删除homology-directed修复(HDR)来进行精确的基因组编辑。但是你是否听说过另一种双链断裂修复机制:MMEJ(微同源介导的末端连接)?MMEJ是另一种末端连接形式，只需要很小的同源区域(5-25 bp)就可以修复，从而更容易构建靶向载体。Addgene储户隆山本的实验室利用MMEJ创建了一种新的CRISPR基因敲入方法，称为PITCh (Precise我捕获到TargetChromosomes)。使用他们的沥青质粒在美国，GFP敲入细胞系可以在大约一个半月的时间内被创造出来，而不需要复杂的同源臂克隆。
MMEJ:介绍
在双链断裂后修复DNA有三种主要方法。HDR从具有侧翼序列同源性的修复模板中复制序列，实现无错误的DSB修复。NHEJ以一种容易出错的方式连接DSB的两端，常见的是插入和删除。相比之下，MMEJ使用DSB侧边5-25 bp的微同源区域来修复DNA。DNA末端被咀嚼回以显示同源性，允许链退火。然后DNA合成填补了空白。最终的结果是微同源性之间区域的缺失和单个微同源性序列的保留。的更多机械细节HDR和NHEJ，请参阅链接的博客文章。
与NHEJ和HDR相比，MMEJ并没有得到太多的报道。然而，这一过程占TALENs和CRISPR突变的百分比。MMEJ在M期和S期早期活跃，而HDR则不活跃，不同的生物对NHEJ、HDR和MMEJ修复的平衡也不同。MMEJ不能产生像HDR那样的“完美修复”，但它比NHEJ更可预测。如图所示，双链断裂侧面的短(5-25 bp)同源区域产生了微同源性之间序列的精确缺失。
MMEJ相对于HDR有一定的优势。一些物种没有良好的HDR系统，即使存在修复模板，NHEJ也会更受青睐。HDR也面临着克隆的困境——同源性越长，重组的效率就越高，但是同源臂越长，克隆的时间就越长。相比之下，MMEJ所需要的短的同源性可以通过PCR扩增轻松添加。鉴于HDR对敲入无效，一些实验室使用NHEJ进行全质粒整合;然而，由于NHEJ是容易出错的，这样的系统很可能会在插入的侧翼引入额外的核苷酸。如果DNA退火结束不正确，除了预期的缺失外，MMEJ还可能引入、替代或删除核苷酸，但频率应低于NHEJ。
推介:利用MMEJ进行基因敲入
基于实验室之前的工作，佐久间等。描述一个mmej介导的将GFP-Puro盒敲入到终止密码子上游的特定位点的详细协议。简单地说，PITCh载体应与GFP-Puro盒侧翼的插入位点具有5 '和3 '的微同源性。敲入需要三个双链断裂:一个在GFP-Puro盒的两侧，一个在基因组位点的5 '和3 '微同源性之间。前两个断裂是通过一个通用的PITCh-gRNA诱导的;第三个断裂由插入位点特异的gRNA完成。这些双链断裂允许两组微同源性(5 '和3 ')进行退火，将GFP-Puro盒敲入位点(见下图)。双mmej策略看起来与HDR非常相似，但它是使用更小的同源区域来完成的，这有利于更容易的克隆。
PITCh缩写协议
步骤1:在PITCh矢量中生成微同源性
通过PCR将~20 bp的5 '和3 '微同源性添加到GFP-Puro盒中，并将该构建物插入到PITCh载体中在融合或SLIC克隆．
步骤2:设计一个插入位点特异的gRNA
gRNA应该以你感兴趣基因的最后一个编码外显子为目标。为了更好的应用，应该将这个gRNA克隆到含有Cas9和PITCh-gRNA的载体中。
第三步:将PITCh载体与携带Cas9的载体以及PITCh-和位点特异性gRNAs进行杂交
第四步:选择嘌呤霉素耐药细胞
第五步:PCR扩增并测序，验证GFP-puro的正确插入
为了降低脱靶效应的风险，Sakuma等人对PITCh-gRNA进行了优化，使其在哺乳动物基因组中实现最小的脱靶结合crispr.mit.edu．他们在HEK293细胞中测试了他们的系统，将GFP-Puro盒集成到FBL轨迹。通过对嘌呤霉素抗性克隆的测序，他们发现80%和50%的克隆分别在5 '和3 '连接处显示正确的插入。这些结果表明，PITCh是一种稳健的基因组插入方法。如果你想将大量的物质整合到基因组中，PITCh也可以适用于整个质粒整合。
开放式问题和替代系统
从Addgene中获得的现成的PITCh质粒非常适合表达绿色荧光蛋白从一个特定的启动子，这项技术可以适用于其他转基因。值得注意的是，观察到的荧光水平将取决于内源性启动子和感兴趣位点的3 ' UTR，因为GFP-Puro将插入终止密码子的上游。一个潜在的问题是GFP-Puro是否会改变它所跟随的基因的表达。
为了增加多功能性，改良PITCh以插入基因将是有利的AAVS1，即人类基因组的“避风港位点”Dalvai et al。他使用HDR将cDNA结构插入该位点。需要问的一个重要问题是，基于pitch的基因组插入的效率与使用核酸酶的CRISPR粘端插入的效率相比如何Cpf1．由于Cpf1以交错模式切割，它被认为是理想的hdr独立敲入，但这种可能性仍在探索中。
更广泛地说，Sakuma等人对MMEJ的使用代表了研究人员可以利用CRISPR基因编辑的另一种策略。在HDR下调的生物体中，MMEJ代表了另一种进行靶向修饰的方法。最近出版的Zhang et al。使用MMEJ将FLAG标签插入到致病真菌的基因组中来自烟曲霉属真菌，由于NHEJ在该物种中优于HDR，因此很难进行修饰。随着CRISPR技术的不断发展，很明显，这个编辑平台的力量在于核酸酶及其应用的多样性。看看MMEJ可以启用哪些新的编辑可能性是很有趣的。
参考文献
1.Sakuma, Tatsushi等(2016)。“mmej辅助基因敲入使用TALENs和CRISPR-Cas9与PITCh系统。”Nat Protoc。11(1): 118 - 33所示。PMID: 26678082．
- 找到本出版物中的质粒在Addgene。
- 从本出版物中找到质粒在Addgene．
3.张驰，张秀华孟，魏晓磊，卢玲。（2016）.“通过微同源性介导的末端连接，高效CRISPR突变来自烟曲霉菌。”真菌麝猫生物。86: 47-57。PMID: 26701308．
Addgene博客上的额外资源188博金宝官网
更多资源请访问Addgene.org
- 在我们的网站上了解CRISPRCRISPR引导页
- 找到CRISPR质粒对你的实验
- 将新的质粒工具存入我们的账户
留下你的评论