你花了数天甚至数周的时间来思考一个惊人的项目。你们已经写好了协议，设计了实验，准备了试剂。你将设计出自CRISPR以来最好的东西;你准备好克隆了!但是……如何?
克隆不再局限于限制性内切酶-尽管许多实验室仍然喜欢使用它们!由于当前可用的技术如此之多，您现在面临着一个挑战，即试图找出哪些系统可能最适合您的特定目的。我们就是来帮忙的!
任何实验需要考虑的四个重要因素是：
- 速度
- 成本
- 困难
- 效率
特别是对于克隆，另一个重要的考虑是:
- 插入的数量
．..因为有些方法比其他方法更适合组合多个DNA片段。
在今天的文章中，我们将重点对流行的克隆方法进行高层次的比较，特别强调这五个类别。请注意，以下许多克隆方法已经在其他文章中进行了广泛的描述;所以如果你有兴趣了解更多关于他们中的任何一个，请点击文本中的链接或查看文章末尾的“附加资源”部分!
速度:
你的资助期限快到了，或者你的导师要求你拿出结果。如果你赶时间，金门克隆也许对你来说是。这种方法依赖于多功能的IIS型限制性内切酶。这些切割超出了他们的限制地点，允许您轻松地创建定制的悬挑，在规定的顺序组装多达6个不同的碎片。这些碎片可以集中在一个管和结扎在短短30分钟!
或者，你可以考虑吉布森克隆．在这项技术中，首先进行一轮PCR，生成末端具有15-40 bp同源性的DNA片段。然后将这些片段与核酸外切酶、聚合酶和DNA连接酶结合，在一个小时或更短的时间内完成一组汇集的连接。连接将这些片段按其同源性决定的顺序结合起来。
你也可以考虑FastCloning，最早由李超昆和同事们．在这里，你只需PCR扩增你的载体和插入物，DpnI消化掉模板，并将PCR产物转化成大肠杆菌．内连接大肠杆菌然后通过PCR过程遗留下来的悬垂物将PCR产物融合在一起(确切的机制尚不清楚)。
最后,威尼斯平底渔船克隆是另一个考虑时间的好方法。这种方法需要一个包含拓扑异构酶I剪切位点、拓扑异构酶I和taq聚合酶生成插入物的载体骨干。当混合时，拓扑异构酶I提供内切酶和连接酶功能，而Taq留下的5 '腺苷悬空与拓扑异构酶I产生的悬空在主干中完美退火。一旦结合，切割和结扎过程发生在几分钟内。
成本:
资金通常是有限的——如果预算特别紧张，你应该使用什么克隆方法?大多数克隆过程都需要一两次PCR反应来生成克隆过程的模板。实际做实验的时间通常也是可比较的，所以比较成本的最好方法是看额外所需酶的价格。
快速克隆可能是所有讨论的选项中最便宜的，因为它只需要PCR和便宜的DpnI酶。否则你会让你的大肠杆菌为你自己做事。
传统的限制性内切酶和连接酶克隆是一种相对便宜的方法来完成这项工作，前提是你已经在实验室里找到了合适的酶。如果没有，你将看到大约50- 60美元每个酶。然而，一旦你有了一些这样的普通酶，你每次克隆反应的成本就会大幅下降，因为一管酶应该足够进行至少50次克隆反应。连接酶的成本与限制性内切酶相当，总的来说，传统限制性内切酶每个反应的价格是几美元。
序列和连接独立克隆（SLIC）也是一个很好的选择，因为这种方法所需的T4聚合酶相对便宜，大约70美元就可以得到，导致每次反应的价格只有几美元。
相比之下，如果你购买预先制作好的混合材料，吉布森组装每反应的成本可以超过15美元。尽管如此，Gibson汇编是一种高度通用和高效的方法，可以生成各种各样的结构。类似的,网关克隆(下面讨论)可以在20-30美元一个反应的订单上运行，但可以用于快速生成多个克隆。
困难:
如果你是一个有经验的克隆者，你可能不会害怕选择正确的酶，优化试剂浓度，或从凝胶中纯化DNA片段．然而，如果你是克隆游戏的新手，或者只是在寻找更合理的方法，你可能会想要尝试Gateway。这种方法由Invitrogen公司开发，基于噬菌体整合序列，依靠BP Clonase和LR Clonase酶混合催化的位点特异性重组反应。通过PCR产生适当的插入物后，就不需要酶切酶切、凝胶纯化或连接。一般的Gateway克隆协议是相当灵活的，适用于克隆不同类型的DNA，如cDNA, PCR片段，或基因组DNA。
还请记住，商业上可获得的克隆工具包往往可以使过程更加精简，因为它们将提供全面和测试的协议，以及预混和准备使用的试剂。赛默费雪科学公司，Origene,内®都是寻找一些有用的工具包的好地方!
效率:
如果你在克隆游戏中付出了那么多努力后，至少能确保你获得一个成功的结果，这不是很好吗?虽然没有任何保证，但一些克隆技术确实会对你有利。首先，由于使用了多用途的II型限制性内切酶，金门克隆极其高效。在金门克隆中，所需的末端结构不包含IIS类型识别位点，允许您在反应中保留IIS类型酶，以重新消化载体重新密封和其他不正确的产品。该特性使反应偏向于期望的装配，以使过程接近100%的效率。
通道克隆也提供了非常高的成功机会(>95%的单一插入)，主要是由于使用有毒的ccdB阻止任何非重组载体的繁殖。像Gibson和SLIC这样独立于结扎的方法也非常有效;虽然效率往往会随着你希望组装的碎片数量的增加而下降。
多个插入:
有一些克隆方法可以轻松处理多个插入。其中包括一些基于同源性的方法，如Gibson或SLIC，因为人们可以通过序列同源性来汇集成分并定义它们的最终顺序。类似地，金门装配允许在用II型限制性内切酶消化后同时完成一组有序的无瘢痕连接。如果要装配的镶件数量特别多，那么所有这些选项都是不错的选择。如果插入数有点小，也可以考虑使用网关，比如说4或更少。
这样的例子不胜枚举……
在这篇文章中，我们回顾了许多最流行的克隆方法，我希望我们也为你的下一个项目提供了一些建议。但请记住，还有许多其他的克隆方法——包括一些仅依赖PCR的方法，以及许多商业上可用的克隆工具，人们可以选择它们来进行这些实验。大多数情况下，正确答案不止一个，所以不要害怕探索多种方法，以找出最适合你的方法。克隆快乐(而且一定要存款你在Addgene完成的结构!)。
工具书类
1.李朝坤，等。快速克隆:一种高度简化、无需纯化、不依赖序列和连接的PCR克隆方法。BMC生物技术11.1(2011):92。PubMedPMID：21992524．公共医学中心PMCID: PMC3207894．
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