在最简单的形式下，基于PCR的克隆就是复制一段DNA，同时在DNA末端添加限制性位点，这样它就可以很容易地克隆到感兴趣的质粒中。可以使用类似的过程向感兴趣的插入添加悬垂吉布森组装．下面的步骤是底漆的设计和PCR过程本身与我们的限制克隆后如果你需要更详细的下游步骤的复习，请查看那篇文章。
在这个例子中，我们将描述如何将一个cDNA从一个载体复制到一个更适合分析基因功能的新载体。这个过程如图所示，我们将EcoRI和NotI位点添加到您的兴趣基因(YGOI)中，连接到受体质粒中。
PCR克隆引物的设计
用于分子克隆的基本PCR引物包括:
领导人序列:引物5'端额外的碱基对协助酶切(通常为3-6bp)
限制站点:您选择的克隆限制位点(通常为6-8bp)
杂交序列:引物与待扩增序列结合的区域(通常为18-21bp)
在选择限制位点时，应使用DNA分析工具，如Addgene的序列分析仪，以便识别在给定序列中存在哪些限制位点。你要选择这样的酶:
不切割在你的插入
在你的受体质粒的理想位置(通常在多重克隆位点(MCS))，但不在质粒的其他地方切割
好处:选择在同一缓冲液中同时发挥作用的限制性内切酶是有帮助的，因为这将节省以后的时间
在我们的例子中，我们将使用EcoRI和NotI将我们的cDNA连接到受体质粒。记住，通过观察MCS，将上游的酶切位点与正向引物融合，将下游的酶切位点与反向引物融合，将DNA以正确的方向插入受体质粒中。
接下来，我们需要检查我们想要扩增的DNA序列并设计能结合并复制它的引物。下面的图片显示了ORF的末端，以及这些是如何用于底漆设计的:
因为我们正在克隆一个ORF，所以我们想从起始密码子(ATG)克隆到终止密码子(TGA，在这个例子中)。假设你是从质粒DNA(而不是从基因组DNA或cDNA文库)中扩增，大约18-21bp通常足以给出特异性，也与标准PCR反应兼容(见PCR视频）.因此，我们的Forward Primer将序列5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'用于与ORF结合的区域，并在该引物的5'末端添加EcoRI限制性位点(GAATTC)，形成我们的Forward Primer 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'。
许多限制性内切酶不能有效地在线性片段的末端切割DNA(见内的更多信息)。因此，我们建议您在限制位点上游添加3-6个碱基，以提高切割效率。一般可以添加任意6个碱基，但要确保碱基不会在底漆内形成发夹结构。在本例中，我们将添加TAAGCA，最终得到一个5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'的Forward Primer序列。
对于反引物，设计是类似的，但是我们需要使用反补来获得PCR扩增。我们可以以类似的方式开始，取ORF的最后18个碱基，包括终止密码子(5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3')，然后加入NotI (GCGGCCGC)和TAAGCA，以提高酶切效率。由此得到5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3'序列(30bp，与ORF同源18bp)。我们现在需要生成这个序列的反向补体，这样我们就可以成功地扩增ORF。您可以使用现有的软件生成反向补充(一个快速的互联网搜索将引导您到在这里和许多其他人一样)。如果我们将我们选择的反向引物序列(5 ' -TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3 ')放入这个计算器，我们就得到了最终的反向引物序列5 ' - tgcttagcggccgctcagtacttcgagatgccca -3 '。
制备用于克隆的PCR产物
进行PCR反应
用PCR扩增插入的DNA。使用高保真度聚合酶来减少突变是很重要的。聚合酶的保真度随着预期聚合产物的长度而变得更加重要。你应该根据与要放大的序列杂交的引物部分的熔化温度(Tm)而不是整个引物的熔化温度(Tm)来选择退火温度。如果你放大从质粒或简单的模板,很少有机会mis-priming,因此您可以使用一个相当广泛的退火温度,但是你可能需要增加引物长度和增加Tm如果你试图从基因组DNA克隆,cDNA库,或者通过rt - pcr。
分离PCR产物
将PCR产物从PCR反应的其余部分中分离出来，使用试剂盒，如QIAquick PCR纯化试剂盒．PCR产物现在可以进行限制性消化。因此，该过程中的后面步骤与我们在本文中讨论的步骤相同限制克隆后．然而，比标准限制克隆更重要的是，你必须验证最终的质粒桑格测序。通过PCR进行DNA复制的错误率从大约每500bp 1个到大约每1000万bp 1个，这取决于所使用的聚合酶。无论你使用哪种聚合酶，重要的是要对最终产品进行测序。
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